大鼠坐骨神經(jīng)華勒氏變性相關(guān)分子通路初步研究

王婷 ，于灝 ，魏侃 ，王寧

（1.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110034；2.沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院 手外科，遼寧 沈陽(yáng) 110024；3.手外科研究所；4.骨科）

周圍神經(jīng)損傷后感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)功能遭到破壞，容易造成傷殘，嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量，大大增加了人們的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-3]。所以尋求治療策略必不可少。雪旺細(xì)胞(SC)在神經(jīng)傳導(dǎo)中和軸突再生過(guò)程中是必不可少的，在外周神經(jīng)損傷后，會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)脫髓鞘以及軸突再生受損，可能造成周圍神經(jīng)病變和神經(jīng)病理性疼痛[4]。它在Wallerian 變性中經(jīng)歷去分化、脫髓鞘、增殖遷移等一系列過(guò)程[5]，形成的Bungner 帶具有引導(dǎo)近端軸突再生的功能[6]。因此，在研究中發(fā)現(xiàn)雪旺細(xì)胞遷移能力增加即可認(rèn)為是神經(jīng)修復(fù)過(guò)程良好的表現(xiàn)。

在先前的體外實(shí)驗(yàn)中，我們已經(jīng)了解到添加外源性PLGF 可提高雪旺細(xì)胞遷移能力，其中ERK1/2信號(hào)通路可能是介導(dǎo)SCs 遷移的重要因素，而AKT信號(hào)通路可能是促進(jìn)SCs 運(yùn)動(dòng)的另一種途徑[7]。MEK-ERK 是一種與細(xì)胞遷移相關(guān)的細(xì)胞通路[8]，抑制該通路一般用于抑制腫瘤細(xì)胞凋亡保護(hù)機(jī)制，是一種較受歡迎的抗腫瘤治療策略[9]。它還與細(xì)胞周期調(diào)控及增殖有關(guān)，在免疫系統(tǒng)中MEK/ERK 在適宜抗原刺激下還可以激活增強(qiáng)細(xì)胞周期進(jìn)展和增殖，但過(guò)度刺激會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯[10]。AKT 在細(xì)胞生長(zhǎng)和存活過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[11]。在外源性神經(jīng)保護(hù)藥物作用下，神經(jīng)元樣細(xì)胞的核及核周區(qū)域以及少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞可發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的磷酸化AKT[12]。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中抑制MEK/ERK 和PI3K/AKT 通路可以導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞的遷移顯著降低[13]，表明ERK 和AKT 的確有可能對(duì)雪旺細(xì)胞的遷移產(chǎn)生影響，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)將ERK 以及AKT 抑制劑直接作用于神經(jīng)，進(jìn)一步證實(shí)ERK 及AKT 調(diào)節(jié)雪旺細(xì)胞遷移的能力。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型建立

SD 大鼠30 只作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，體重180～220 g，由沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。所有程序均按照動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)的協(xié)議進(jìn)行。0.2%氯胺酮和0.2%地西泮混合溶液，予2.5 mL/100 g 腹腔注射麻醉，按照無(wú)菌原則暴露坐骨神經(jīng)，以坐骨大孔處即閉孔內(nèi)肌近端1.0 cm 平面為壓斷界面，使用恒力裝置施加10 N 的力進(jìn)行壓迫，以壓迫后復(fù)夾神經(jīng)損傷處鼠呈無(wú)反應(yīng)狀態(tài)為宜。按說(shuō)明配置工作液U0126（9903，Cell Signaling） 及 LY294002（9901，Cell Signaling）。此前實(shí)驗(yàn)證實(shí)其最適合濃度分別為30μM 和10μM[7]。規(guī)定大鼠右肢為實(shí)驗(yàn)組，左肢為對(duì)照組。對(duì)照組均僅作壓傷處理，實(shí)驗(yàn)組在壓傷處理后使用微量注射器（HAMILT）分別注入飽和量工作液。

1.2 樣本取材

分別于術(shù)后 12 h、24 h、3 d、7 d、14 d 各時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取出3 只大鼠，以空氣栓塞的方法處死，切取雙側(cè)神經(jīng)解合口兩端至少0.5 cm 長(zhǎng)的坐骨神經(jīng)，于-80℃冷凍保存。

1.3 免疫組化化學(xué)染色

經(jīng)脫蠟水化、0.01 M 的PBS 清洗后，正常兔血清封閉30 min 后傾掉，加入p-75 NGF Receptor 重組抗體（EP1039Y，Abcam，美國(guó)），在 4℃環(huán)境下孵育過(guò)夜。第 2 天經(jīng) 0.01M 的 PBS 清洗，滴加兔 IgG（SA1022，博士德，中國(guó)），室溫封閉30 min 后再以經(jīng)0.01 M 的PBS 清洗。加入新鮮DAB 工作液濕盒封閉，于鏡下監(jiān)測(cè)到合適顯色后水洗，再入蘇木素復(fù)染后水洗，最后入酸乙醇分化后水洗，脫水封片。

1.4 組織學(xué)評(píng)價(jià)

應(yīng)用Image Pro Plus 6.0 分析上述切片p-75 NFR 免疫組化陽(yáng)性程度及Bungner 帶數(shù)量。以平均光密度值[Density(mean)]表達(dá)免疫組化陽(yáng)性程度；以3～5 個(gè)連成一線的細(xì)胞核作為Bungner 帶來(lái)計(jì)數(shù)。每張切片均于高倍視野下（×200）隨機(jī)取3 個(gè)視野進(jìn)行分析計(jì)算。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

1.6 Western blot 測(cè)定蛋白

1.6.1 細(xì)胞樣本全蛋白提取

將組織盡量剪碎，在每1.0 mL 冷Lysis Buffer中加入10μL 磷酸酶抑制劑、1μL 蛋白酶抑制劑和5μL 100 mM PMSF，混勻，冰上保存數(shù)分鐘待用。組織塊轉(zhuǎn)至新的預(yù)冷的離心管中，加入上述配制好的冷Lysis Buffer。置于4℃搖床平臺(tái)上，溫和振蕩15 min，14 000 rpm/min，4℃離心 15 min，取上清為全蛋白提取物。

1.6.2 蛋白定量（Bradford 法）

根據(jù)凱基Braford 蛋白含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，取待測(cè)蛋白樣品適量，加入考馬斯亮蘭 G250 染液 990 mL，混勻，測(cè)定 595 nm OD 值，然后在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求所得濃度。

1.6.3 SDS-PAGE 電泳

成層膠聚合后，小心拔去樣品梳子，然后加入lxTris-Gly 的電泳緩沖液。吸取適量樣品上清加入樣品孔中，在樣品旁的孔中加入預(yù)染的蛋白Marker，未添加樣品上清的孔中，加入l×SDS 上樣緩沖液保持膠面平衡。電壓開(kāi)始設(shè)置為60 V，當(dāng)?shù)鞍讟悠愤M(jìn)入分離膠后，電壓可提高到 90 V。參照預(yù)染Marke 的位置，待目的條帶進(jìn)入凝膠最佳分離區(qū)(大約凝膠的2/3)時(shí)，停止電泳。預(yù)先將轉(zhuǎn)膜液4℃預(yù)冷。托盤上打開(kāi)轉(zhuǎn)移盒，靠近陰極側(cè)的內(nèi)面鋪上己經(jīng)用轉(zhuǎn)膜緩沖液浸濕的有孔維墊，其上放3 層浸有轉(zhuǎn)膜緩沖液的Whatman3 MM 濾紙，注意排凈氣泡。小心撬開(kāi)玻璃板，將膠放置含有轉(zhuǎn)膜液的托盤內(nèi)，將含有目的條帶的分離膠切下，用轉(zhuǎn)膜液浸泡后置于濾紙上。在凝膠上鋪上經(jīng)甲醇和轉(zhuǎn)膜液浸濕的NC 膜，膠和膜之間不能存有氣泡，膜、濾紙和凝膠的大小大致相同。在NC 膜上再放兩層浸過(guò)轉(zhuǎn)膜液的Whatman 濾紙，注意排凈氣泡。放上第二塊海綿墊，使整個(gè)轉(zhuǎn)印夾層依次形成“纖維墊-濾紙-凝膠-NC 膜-濾紙-纖維墊”層次，關(guān)閉轉(zhuǎn)印夾，放入轉(zhuǎn)移槽中，槽中灌滿轉(zhuǎn)膜液。打開(kāi)電源，穩(wěn)流200 mA，120 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出NC 膜并作好標(biāo)記，用TBST 洗膜10 min×3 次。

圖1 Bungner 帶形成情況

圖1f 為術(shù)后 12 h、1 d、3 d、7 d、15 d 時(shí) p-75 NGFR 半定量表達(dá)，可見(jiàn)3d 時(shí)p-75 NGFR 的表達(dá)達(dá)到峰值

圖2 對(duì)照組p-ERK1/2 及p-AKT 的表達(dá)及Bungner帶的變化情況

圖3 U0126 干預(yù)下p-ERK1/2及 p -AKT 的 表 達(dá) 及Bungner 帶的變化情況

圖4 U0126+LY294002 干預(yù)下 p-ERK1/2 及 p-AKT 的表達(dá)及Bungner 帶的變化情況

1.6.4 封閉、抗原抗體反應(yīng)

封閉：將NC 膜放入平皿中，加入含5%脫脂奶粉的封閉液，搖床振蕩1.5～2 h。封閉結(jié)束后，用TBST洗膜10 min×3 次。將膜放入含一抗 (ERK (4695，Cell Signaling,USA),p-ERK(4370,Cell Signaling,USA),AKT(4691,Cell Signaling,USA),p-AKT(4060,Cell Signaling,USA) 的平皿中，4℃搖床振蕩孵育過(guò)夜。第2 天取出，室溫振蕩30 min，吸棄一抗，TBST洗10 min×3 次。用5%脫脂奶粉封閉液稀釋二抗，室溫?fù)u床振蕩反應(yīng)1～2 h。二抗反應(yīng)結(jié)束后，回收二抗。然后用 TBsT 洗膜 5～10 min×3 次。將 EcL 化學(xué)發(fā)光試劑盒中的A、B 兩種液體按l∶l 等體積混合，配置成工作液備用。將NC 膜從TBsT 中取出，甩掉多余的液體，將含有蛋白質(zhì)的膜正面朝上，滴加適量工作液，用保鮮膜覆蓋。使用G:BOX chemiXR5 成像。使用Gel-Pro32 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 華勒氏變性遠(yuǎn)端神經(jīng)p-75 NGFR 表達(dá)

大鼠坐骨神經(jīng)損傷后遠(yuǎn)端各時(shí)間點(diǎn)的p-75 NGFR 的表達(dá)均呈陽(yáng)性；隨著時(shí)間推移而p-75 NGFR表達(dá)逐漸增加（圖1a-e），至3 d 時(shí)表達(dá)達(dá)到峰值（圖1f）。

2.2 Bungner 帶的形成

大鼠坐骨神經(jīng)損傷后，遠(yuǎn)端在損傷后1 d 觀察到Bungner 帶并未廣泛形成，有多處3～5 個(gè)細(xì)胞核成行排列，Bungner 帶尚處在形成過(guò)程中（圖1b）。遠(yuǎn)端神經(jīng)在損傷3 d 后各時(shí)間點(diǎn)p-75 NGFR 陽(yáng)性染色的激活態(tài)雪旺細(xì)胞高度增值，細(xì)胞核呈條帶狀排列形成 Bungner 帶（圖 1c-e）。

2.3 Bungner 帶形成與ERK1/2 及AKT 信號(hào)相關(guān)

隨著華勒氏變性時(shí)間推移，Bunger 帶形成數(shù)量增加并伴隨著p-ERK1/2 表達(dá)明顯增加，p-AKT 無(wú)明顯改變（圖2）；在神經(jīng)損傷遠(yuǎn)端注射MEK 抑制劑U0126（30μM），結(jié)果 Bungner 帶形成數(shù)量趨勢(shì)無(wú)明顯改變（圖3）。在神經(jīng)損傷遠(yuǎn)端注射MEK 抑制劑U0126 及 LY294002(10μM)，結(jié)果 Bungner 帶形成數(shù)量明顯減少（圖4）。

3 討論

大鼠坐骨神經(jīng)損傷后，神經(jīng)遠(yuǎn)端發(fā)生華勒氏變性，雪旺細(xì)胞由靜息態(tài)被激活，特異性表達(dá)p-75 NGFR 經(jīng)歷去分化、增值，并遷移形成Bungner 帶從而引導(dǎo)軸突再生。本研究中華勒氏變性神經(jīng)遠(yuǎn)端各時(shí)間點(diǎn)的p-75 NGFR 表達(dá)均呈陽(yáng)性，客觀反映了華勒氏變性雪旺細(xì)胞被激活后p-75 NGFR 的持續(xù)表達(dá)狀態(tài)。在此過(guò)程中由起初的激活態(tài)雪旺細(xì)胞3～5 成行，3 d 后各時(shí)間點(diǎn)形成Bungner 帶形成由少至多，這與Vargas 等報(bào)道結(jié)果相符[14]。

神經(jīng)損傷華勒氏變性中，Bungner 帶形成數(shù)量與p-ERK 表達(dá)呈正相關(guān)，p-AKT 表達(dá)未見(jiàn)明顯改變。但當(dāng)在神經(jīng)損傷遠(yuǎn)端單獨(dú)注射MEK 抑制劑U 0126時(shí)，結(jié)果顯示Bungner 帶數(shù)量未見(jiàn)明顯減少。而同時(shí)應(yīng)用U 0126 及LY 294002 后Bungner 帶形成數(shù)量在各時(shí)間點(diǎn)明顯減少，說(shuō)明ERK 信號(hào)途徑及PI3K 途徑可能與雪旺細(xì)胞遷移相關(guān)，并同時(shí)參與Bungner 帶形成，其中具體機(jī)制有待我們進(jìn)一步研究。另外，我們觀察到p-ERK 及p-AKT 在抑制劑注射3 d 后逐漸開(kāi)始表達(dá)，這可能與抑制劑在動(dòng)物體內(nèi)有效作用時(shí)段或有效作用劑量相關(guān)。