黃育濤 蔡幸生 朱勇斌

揭陽(yáng)市人民醫(yī)院(揭陽(yáng) 522000)

肺炎(Pneumonia)是兒童的一種主要常見病, 其中絕大部分兒童肺炎為社區(qū)獲得性肺炎(community acquired pneumonia,CAP)。引起CAP的病原微生物包括細(xì)菌、病毒、肺炎支原體、肺炎衣原體、真菌等[1- 2]，近年來(lái)肺炎支原體(mycoplasma pneumonia,MP)感染的肺炎比例有所增加,10%～40%的住院兒童CAP是由肺炎支原體感染引起的[3- 4]。肺炎支原體肺炎(mycoplasma pneumonia pneumonia,MPP)的診斷除了要具備肺炎的表現(xiàn)和/或影像學(xué)依據(jù)外，還要結(jié)合MP病原學(xué)檢查。核糖核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RNA simultaneous amplification and testing,RNA-SAT)是新一代病原體檢測(cè)技術(shù)，能快速準(zhǔn)確檢測(cè)出活的病原體，可用于早期診斷[5]。近年來(lái)RNA-SAT已開始應(yīng)用于兒童MP病原學(xué)檢測(cè)，但對(duì)其臨床應(yīng)用價(jià)值的報(bào)道較少。本研究通過(guò)對(duì)310例CAP的MP RNA-SAT和MP-IgM檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行回顧性比較分析，旨在探討MP RNA-SAT對(duì)兒童社區(qū)獲得性肺炎早期診治的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇廣東省揭陽(yáng)市人民醫(yī)院兒科住院部2018年 1月—2019年 6 月收治的CAP患兒310例臨床資料進(jìn)行回顧性分析，其中MPP組155例，男75例、女80例，年齡4月～13歲；非MPP組155例，男78例、女77例，年齡5月～12歲。兩組患兒一般資料無(wú)明顯差異，具有可比性。

1.2 入組標(biāo)準(zhǔn)

所有患兒的臨床診斷均符合社區(qū)獲得性肺炎[2]，MPP組的患兒符合肺炎支原體肺炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；非MPP組則不符合，且存在其他病原體感染的實(shí)驗(yàn)室檢查證據(jù)。

1.3 檢驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)本采集：兩組患兒均于入院24小時(shí)內(nèi)予無(wú)菌采集咽拭子標(biāo)本行MP RNA-SAT檢測(cè)和采集靜脈血做MP IgM檢測(cè)。

1.3.2 MP RNA-SAT檢測(cè)：①T7核酸擴(kuò)增:向標(biāo)本中加入20 μL細(xì)胞裂解液，旋渦震蕩30 s，室溫裂解10～15 min，95 ℃孵育2 min，42 ℃穩(wěn)定2 min后，加入1 μL擴(kuò)增酶混勻，42 ℃恒溫?cái)U(kuò)增60 min。②多生物素信號(hào)放大檢測(cè):將15 μL擴(kuò)增產(chǎn)物和4 μL放大探針稀釋到200 μL 42 ℃的雜交液中，混勻，每孔加60 μL到微板孔內(nèi)，并向每孔加入10 μL相應(yīng)的特異探針；貼上封板膜，50 ℃孵育60 min;除去封板膜，每孔加入200 μL預(yù)熱的洗液A洗板，重復(fù)3次；然后每孔加入200 μL封閉液，棄去孔內(nèi)液體，每孔再加入100 μL酶聯(lián)物；42 ℃孵育10～15 min，向每孔加入200 μL預(yù)熱的洗板液B洗板，重復(fù)3次；按底物稀釋液:底物A:底物B=8:1:1的比例配制底物工作液，每孔加入95 μL底物工作液，1 min內(nèi)置于化學(xué)發(fā)光儀上進(jìn)行相對(duì)光單位(RLU)測(cè)定，儀器自動(dòng)進(jìn)行結(jié)果判斷。所有操作均嚴(yán)格按照設(shè)備和試劑說(shuō)明及實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行。使用設(shè)備、試劑：化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀TZD-CL- 200S(廈門天中達(dá)生物科技有限公司)，迷你金屬浴(杭州奧盛儀器有限公司)，肺炎支原體肺炎衣原體核酸檢測(cè)試劑盒(雙擴(kuò)增法)(武漢中幟生物科技股份有限公司)。

1.3.3 MP-IgM檢測(cè)：取20 μL全血樣本加到試劑條指示箭頭下端邊緣加樣處，垂直滴加2滴(約100 μL)樣本稀釋液，5～10 min內(nèi)若出現(xiàn)檢測(cè)線和質(zhì)控線，判為陽(yáng)性；若僅出現(xiàn)質(zhì)控線，且10 min內(nèi)未出現(xiàn)檢測(cè)線，判為陰性，10 min后判讀結(jié)果無(wú)效。所選試劑：肺炎支原體IgM抗體檢測(cè)試劑(膠體金法)(珠海麗珠試劑股份有限公司)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 檢驗(yàn)結(jié)果

具體見表1。

表1 兩組患兒MP檢驗(yàn)結(jié)果 例

2.2 RNA-SAT和IgM診斷MPP的準(zhǔn)確性比較

RNA-SAT的特異度及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值高于IgM，而敏感度及陰性預(yù)測(cè)值則低于IgM，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2所示。

表2 RNA-SAT和IgM診斷MPP的準(zhǔn)確性比較 %

2.3 影響RNA-SAT檢出率的相關(guān)因素

將性別、年齡、檢測(cè)時(shí)間、本次病程是否使用大環(huán)內(nèi)酯類藥物和檢測(cè)標(biāo)本分別作為影響RNA-SAT檢出率的可能因素進(jìn)行單因素分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)年齡>3歲、檢測(cè)前不使用大環(huán)內(nèi)酯類藥物以及選擇肺泡灌洗液作為檢測(cè)標(biāo)本均能提高RNA-SAT的檢出率，結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；性別和檢測(cè)時(shí)間對(duì)RNA-SAT的檢出率無(wú)影響(P>0.05)，見表3。

表3 RNA-SAT在不同因素影響下的檢出率

3 討 論

CAP是指社區(qū)(醫(yī)院外)發(fā)病的感染性肺炎，包括了在社區(qū)感染病原體而在醫(yī)院發(fā)病的肺炎。MP是CAP的主要病原體之一，肺炎支原體肺炎治療首選是阿奇霉素[6- 7]。隨著大環(huán)內(nèi)酯類抗生素在兒童呼吸道疾病中的大量應(yīng)用，大環(huán)內(nèi)酯類耐藥的肺炎支原體肺炎逐漸增加[8- 10]。馮雪莉[11]等報(bào)道的首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院兒童肺炎支原體肺炎的耐藥比例高達(dá)86.7%，早期診斷并及時(shí)有效的抗生素治療對(duì)控制耐藥形勢(shì)的蔓延尤為重要。肺炎支原體肺炎具有癥狀體征不典型、影像學(xué)改變多樣化的臨床特點(diǎn)[12]，診斷難度偏大，所以快速準(zhǔn)確的病原學(xué)檢查對(duì)肺炎支原體肺炎的早期診斷意義重大。目前MP病原學(xué)檢測(cè)方法有分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測(cè)、核酸檢測(cè)(DNA和RNA)3類方法，其中MP常規(guī)培養(yǎng)需要時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)早期診斷意義不大，快速培養(yǎng)則敏感度及特異度均較差。MP抗體在感染1周后出現(xiàn)，可長(zhǎng)期存在，即使在疾病痊愈后仍可存在1～3個(gè)月以上，不好區(qū)分是現(xiàn)癥感染還是既往感染；恢復(fù)期和急性期MP-IgM抗體滴度呈4倍或4倍以上增高或減低時(shí)可確診為MP感染，這需在急性期和恢復(fù)期各采集血液標(biāo)本，花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，不利于臨床早期診斷[7，13]。MP-DNA在體內(nèi)持續(xù)攜帶的中位時(shí)間是其感染后7周，個(gè)別長(zhǎng)達(dá)7月，所以DNA檢測(cè)無(wú)法區(qū)分現(xiàn)癥感染與攜帶狀態(tài)，需動(dòng)態(tài)觀察[14]。RNA-SAT作為一種新型的分子生物診斷技術(shù)，能針對(duì)病原體的靶標(biāo)RNA實(shí)現(xiàn)特異度的擴(kuò)增和檢測(cè)，由于RNA只存在于增殖存活的病原體內(nèi)，能夠區(qū)分感染和攜帶，同時(shí)具有極高的靈敏性，更適用于臨床早期診斷[15]。

本研究對(duì)310例CAP患兒(其中MPP組155例，非MPP組155例)的MP檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行回顧性分析，發(fā)現(xiàn)RNA-SAT的特異度及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值明顯高于IgM，意味著RNA-SAT(+)能更加準(zhǔn)確地反映MP的現(xiàn)癥感染，RNA-SAT可以彌補(bǔ)單次IgM檢測(cè)假陽(yáng)性偏多的不足，從而減少M(fèi)PP的過(guò)度診斷。而IgM在敏感度及陰性預(yù)測(cè)值方面比較有優(yōu)勢(shì)，說(shuō)明IgM(-)能更好地排除MP感染，同時(shí)也要注意到是否存在著標(biāo)本采集操作不當(dāng)引起RNA-SAT假陰性增多，進(jìn)而導(dǎo)致RNA-SAT敏感度偏低的可能性。

對(duì)于可能影響RNA-SAT檢出率的因素進(jìn)行單因素分析，結(jié)果提示年齡>3歲、檢測(cè)前不使用大環(huán)內(nèi)酯類藥物以及選擇肺泡灌洗液作為檢測(cè)標(biāo)本均能提高RNA-SAT的檢出率，考慮可能是下列原因?qū)е拢孩倌挲g大的患兒在取檢過(guò)程比較配合，容易取到合格的檢測(cè)標(biāo)本；②RNA-SAT檢測(cè)的目標(biāo)是存活的病原體的RNA，檢測(cè)前使用大環(huán)內(nèi)酯類藥物治療可導(dǎo)致部分MP被清除，從而出現(xiàn)相應(yīng)的那部分結(jié)果陰性；③咽拭子與肺泡灌洗液相比，容易受到咽部正常定植菌和取檢操作的影響，所以檢出率比肺泡灌洗液的低。

綜上所述，由于MP感染后MP-IgM在體內(nèi)持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，臨床工作中僅予MP-IgM抗體檢測(cè)可能存在較大誤診風(fēng)險(xiǎn)，導(dǎo)致濫用抗生素，進(jìn)而增加抗生素耐藥風(fēng)險(xiǎn)。MP RNA-SAT能準(zhǔn)確識(shí)別出活動(dòng)性感染，聯(lián)合使用RNA-SAT和IgM檢測(cè)并綜合分析，能更加快速、準(zhǔn)確地診斷MP感染，有利于臨床合理使用抗生素，減少抗生素耐藥風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)兒童肺炎的診治具有較高的價(jià)值，值得臨床醫(yī)師借鑒。在使用RNA-SAT檢測(cè)時(shí)，盡量在使用大環(huán)內(nèi)酯類藥物治療前由經(jīng)過(guò)專門培訓(xùn)的工作人員進(jìn)行咽拭子取檢，必要時(shí)可選擇肺泡灌洗液進(jìn)行檢測(cè)以提高檢出率。