范吉釴 柯義強(qiáng) 劉紅海

摘 要：生物活性肽是一類結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的分子聚合物，具有多種生理功能，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。微生物發(fā)酵法制備生物活性肽是通過菌種在生長(zhǎng)代謝過程中產(chǎn)生的蛋白酶水解底物蛋白從而制備生物活性肽的方法，其工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低、更易于產(chǎn)業(yè)化，應(yīng)用前景廣闊。該文對(duì)微生物發(fā)酵法制備ACE抑制肽、抗氧化肽、抗菌肽和免疫活性肽的研究進(jìn)展以及發(fā)酵肽產(chǎn)物的分離純化方法進(jìn)行了綜述，并對(duì)微生物發(fā)酵法制備生物活性肽的研究趨勢(shì)進(jìn)行了展望，為今后發(fā)酵法制備生物活性肽的進(jìn)一步研究提供參考。

關(guān)鍵詞：生物活性肽;發(fā)酵法;抗氧化活性肽;超濾

Abstract：Bioactive peptide is a molecular polymers with a structure between amino acid and protein，which has become the focus of current research because of its several physiological functions. Biologically active peptides prepared by microbial fermentation which is a method of preparing biologically active peptides by proteolytic produced by bacteria during the growth and metabolism process hydrolysis of substrate proteins has simple process，low production cost，easier industrialization，and broad application prospects. In this paper，the research progress of ACE inhibitory peptides，antioxidant peptides，antibacterial peptides，and immunoactivity peptides prepared by microbial fermentation and the methods of separation and purification of fermented peptide products are reviewed. It will provide references for the further studies on the preparation of biologically active peptides by the method of microbial fermentation.

Key words：Bioactive peptide;Fermentation;Antioxidant active peptide;Ultrafiltration

生物活性肽又稱功能性多肽，是一種相對(duì)分子質(zhì)量小于6000且具有多種生理功能的化合物[1-3]，它是一類是來源于蛋白質(zhì)，由氨基酸經(jīng)共價(jià)鍵連接而成的多功能化合物，對(duì)人體免疫和神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、消化功能和心血管系統(tǒng)都有著重要的調(diào)節(jié)作用[4]，并且還具有抗氧化、調(diào)節(jié)血壓、降低膽固醇、抑菌、抗腫瘤、提高免疫力、防癌等生理功能[5-7]。生物活性肽具有極高的食用安全性，已經(jīng)成為當(dāng)前國(guó)際上極具發(fā)展前景的功能因子和食品界最熱門的研究課題。

生物活性肽的制備方法主要肽的包括酶解法、微生物發(fā)酵法、化學(xué)合成法和基因工程重組法等[8]。酶解法是一種常見的制備方法，特異性強(qiáng)，工藝比較成熟，但是成本較高;基因工程重組法表達(dá)短肽鏈有較大難度且效率低下，僅可以合成大分子肽;化學(xué)合成法生產(chǎn)成本高，殘留物和副反應(yīng)多，限制了其規(guī)?；a(chǎn)。與其他方法相比，微生物發(fā)酵法制備生物活性肽的發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，比其他方法更易于工業(yè)化。本文主要通過介紹了發(fā)酵法制備生物活性肽的研究進(jìn)展以及多肽產(chǎn)物的分離純化方法，以期為發(fā)酵法制備生物活性肽的研究提供參考。

1 微生物發(fā)酵法概述

發(fā)酵法是利用微生物菌種在生產(chǎn)代謝過程中產(chǎn)生的蛋白酶來水解底物蛋白制備生物活性肽的方法。微生物在代謝過程中可以產(chǎn)生復(fù)合酶系，通過酶解釋放出特定的高濃度生物活性肽，酶解效率更高;同時(shí)，還能夠產(chǎn)生肽酶除去苦味肽，使生物活性肽產(chǎn)品的口感風(fēng)味更好[9];在發(fā)酵過程中，微生物菌體本身在一系列的代謝作用下也能夠合成和分泌小肽類物質(zhì);此外，菌體的代謝產(chǎn)物可以進(jìn)一步修飾某些功能基團(tuán)，提高其生物活性[10]。目前，用于發(fā)酵法制備生物活性肽的菌種主要有枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、曲霉菌以及乳酸菌等。張樹華等[11]利用枯草芽孢桿菌1.0892與黑曲霉3324混合菌種發(fā)酵綠豆蛋白粉制備綠豆多肽，結(jié)果表明，綠豆多肽有較強(qiáng)的抗氧化能力，其超氧陰離子清除率是46.57%，·OH清除率為47.26%。王鑾等[12]采用枯草芽孢桿菌與米曲霉混合來發(fā)酵榛仁粕制備榛仁肽，并優(yōu)化混合菌的固態(tài)發(fā)酵工藝，結(jié)果表明，當(dāng)混合菌種米曲霉和枯草芽孢桿菌比例為1∶1，在水分含量為60%、接種量15%、發(fā)酵溫度40℃條件下發(fā)酵48h的產(chǎn)物對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力達(dá)到98.75%。一些微生物發(fā)酵法制備生物活性肽的菌種及其作用蛋白底物見表1。

2 發(fā)酵法制備生物活性肽

2.1 ACE抑制肽 高血壓是一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性疾病，目前已經(jīng)成為世界性研究課題。ACE抑制劑是目前臨床上常用的降血壓藥物，大多為化學(xué)合成劑，長(zhǎng)期服用后易引起皮疹、咳嗽、味覺功能紊亂等副作用，因此，人們?cè)絹碓絻A向?qū)ふ姨烊籄CE抑制劑。高丹丹等[13]采用市售腐乳和泡菜中篩選出來的微生物菌體發(fā)酵馬鈴薯蛋白制備ACE抑制肽，其發(fā)酵產(chǎn)物的水解度為7.72%，ACE抑制率為86.94%。程龍等[14]從云南發(fā)酵食品中篩選和分離出具有ACE抑制活性的乳酸菌，進(jìn)一步研究乳酸菌的益生特性和發(fā)酵脫脂乳過程中產(chǎn)物的ACE抑制率的動(dòng)態(tài)變化，結(jié)果表明，Lb.plantarumYM-4-3菌株在37℃發(fā)酵脫脂乳48h產(chǎn)生多肽的ACE抑制率可達(dá)到81.23%。Bao等[15]分別采用10種不同干酪乳桿菌發(fā)酵豆奶，經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵產(chǎn)物均具有一定ACE抑制活性。常通[16]分離篩選出一株高效安全的枯草芽孢桿菌NCT314，發(fā)酵脫酚棉籽蛋白制備ACE抑制肽，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化其發(fā)酵條件，棉籽蛋白發(fā)酵液的水解度可達(dá)到18.36%，ACE抑制率為64.86%。蓋夢(mèng)[17]采用發(fā)酵法水解裸燕麥中的蛋白制備具有ACE抑制肽和抗氧化肽，發(fā)酵液進(jìn)一步通過半制備型RP-HPLC分離純化后得到純度較高的ACE抑制肽，其ACE抑制活性為70.12%。Wang等[18]利用納豆菌對(duì)豆粕進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，產(chǎn)物進(jìn)一步經(jīng)超濾、葡聚糖凝膠層析和RP-HPLC分離純化步驟后，測(cè)得多肽的ACE抑制活性為84.1%，IC50值為0.022mg/mL。劉穎等[19]采用復(fù)合菌液態(tài)發(fā)酵米糠制備ACE抑制肽，研究原料預(yù)先處理方式對(duì)發(fā)酵過程的影響，發(fā)現(xiàn)原料經(jīng)膨化預(yù)處理后，多肽的轉(zhuǎn)化率和ACE抑制率均高于淀粉預(yù)處理，多肽轉(zhuǎn)化率能夠達(dá)到38.86%，且ACE抑制活性為64.48%。李響等[20]以大豆分離蛋白為底物，以肽含量和ACE抑制率為檢測(cè)指標(biāo)，采用多種微生物對(duì)其發(fā)酵進(jìn)而篩選出具有高ACE抑制活性的發(fā)酵菌株，研究發(fā)現(xiàn)，保加利亞乳桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物具有最強(qiáng)ACE抑制活性，測(cè)得其ACE抑制率為57.93%，肽含量為3.27mg/mL。

2.2 抗氧化活性肽 活性氧和自由基與人體衰老有關(guān)，細(xì)胞內(nèi)過多活性氧和自由基的存在，會(huì)引起癌癥、老年癡呆等疾病[21]?？寡趸钚噪目梢源龠M(jìn)過氧化物和自由基的分解，清除體內(nèi)多余的活性氧和自由基，從而保護(hù)人體免受氧化傷害。杜昕等[22]采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵牦牛血制備抗氧化肽，進(jìn)一步以發(fā)酵解液的·OH清除率為主要指標(biāo)優(yōu)化發(fā)酵條件，最終確定底物濃度75g/L，接種量2.5%（V/V），發(fā)酵時(shí)間69.5h為最佳發(fā)酵條件，此時(shí)抗氧化肽的·OH清除率為74.48%，最終發(fā)酵液的多肽含量為2.31mg/mL。夏琪娜等[23]采用微生物發(fā)酵法制備活性肽WPI和GA，研究其對(duì)微膠囊過氧化值的影響，結(jié)果表明：添加0.1%抗氧化肽，微膠囊的POV值增量與對(duì)照組相比減小，說明抗氧化肽對(duì)過氧化值影響顯著（P<0.05）。胡姝敏等[24]優(yōu)化發(fā)酵法制備乳清蛋白抗氧化肽的發(fā)酵工藝參數(shù)，結(jié)果表明，當(dāng)乳清蛋白含量為10%，接種量為3.5%，溫度43.3℃，發(fā)酵時(shí)間63h為最佳發(fā)酵條件。楊麗娜[25]通過自篩菌種和商業(yè)化菌種復(fù)配了2株協(xié)同作用良好的乳酸菌復(fù)合菌種，結(jié)果表明，當(dāng)2種菌種復(fù)配比例為1∶1，接菌量4%，在42℃下發(fā)酵5.5h時(shí)羊乳發(fā)酵乳的感官性能最好，此時(shí)該發(fā)酵乳的·OH清除率為89.85%，DPPH清除率為85.30%，F(xiàn)e2+螯合能力為20.76%，具有顯著的抗氧化活性。

2.3 抗菌肽 抗菌肽一般是由2～15個(gè)氨基酸序列構(gòu)成的小肽，具有良好的殺菌活性和免疫學(xué)活力，對(duì)病毒、癌癥細(xì)胞有一定的殺傷作用。相比于抗生素，抗菌肽在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞不產(chǎn)生毒性，對(duì)機(jī)體自身不產(chǎn)生傷害[26]，且不易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，因而其在抗癌藥物的開發(fā)方面具有很大的潛力。彭建等[27]通過氨基酸替換和序列截短的方法來改造抑菌肽Cec4，發(fā)現(xiàn)與母肽相比，Cec4經(jīng)過氨基酸替換后對(duì)各測(cè)試菌抑菌活性提升1倍，Cec4在截短后喪失抑菌活性，而且抗菌肽在1mg/mL濃度下對(duì)人體無溶血反應(yīng)。曹丁等[28]通過優(yōu)化芽孢桿菌GL08發(fā)酵培養(yǎng)基的配方來提高抗菌肽的產(chǎn)量，在優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，500L中試水平殺菌效價(jià)提高90%左右，為15311 IU/mL，這種發(fā)酵工藝降低了抗菌肽的生產(chǎn)成本，并且提高了穩(wěn)定性，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供了新的思路，同時(shí)為抗菌肽的商業(yè)化應(yīng)用奠定了良好的理論基礎(chǔ)。張志焱等[29]通過對(duì)優(yōu)化一株枯草芽孢桿菌BL0006的發(fā)酵條件和配方來提高發(fā)酵液中抗菌肽的效價(jià)，優(yōu)化后效價(jià)為4.25×104U/mL，是優(yōu)化前的3.51倍，能夠達(dá)到高產(chǎn)、降低成本、縮短發(fā)酵時(shí)間的效果。

2.4 免疫活性肽 免疫活性肽是一類具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、促使淋巴細(xì)胞分化成熟和轉(zhuǎn)移免疫信息等生理功能特性的多肽類的總稱[30]，具有促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖、增強(qiáng)自噬細(xì)胞（NK）的機(jī)能、提高巨噬細(xì)胞活性、促進(jìn)細(xì)胞因子生成等功能[31-32]，同時(shí)也可鞏固機(jī)體防御能力和提高機(jī)體的免疫力，并且具有無毒、低過敏性、高安全性等優(yōu)點(diǎn)，在人類營(yíng)養(yǎng)健康和疾病預(yù)防中發(fā)揮著重要的作用[33]。李善仁等[34]采用米曲霉和芽孢桿菌CS27發(fā)酵豆粕，發(fā)現(xiàn)當(dāng)2種菌株的接種比例為1∶2，30℃下發(fā)酵48h時(shí)大豆肽得率和大豆肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為51%，23.98%。Elfahri等[35]采用3種不同的瑞士乳桿菌及其粗酶提取液（CPE）在37℃條件下發(fā)酵牛奶蛋白12h，發(fā)現(xiàn)獲得的短肽混合物均可以促使IFN-γ的含量的增加和人外周血單核細(xì)胞（PBMCs）中IL-10的分泌。侯銀臣等[36]用枯草芽孢桿菌對(duì)羊胎盤下腳料發(fā)酵來制備免疫活性肽，結(jié)果表明，當(dāng)料液pH5.42、發(fā)酵時(shí)間為43.45h、碳源含量1.73%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞的刺激效果明顯;當(dāng)發(fā)酵液中蛋白為100μg/mL時(shí)，小鼠脾淋巴細(xì)胞的刺激指數(shù)為23.26%，與100μg/mL LPS和50μg/mL Con A共同作用的免疫效果顯著。張奕[37]通過發(fā)酵駝乳制備免疫活性肽，結(jié)果表明駝乳多肽能夠降低BALB/C小鼠脾淋巴細(xì)胞中IL-6和NF-κB的mRNA相對(duì)表達(dá)量，同時(shí)能夠升高IFN-γ、IL-23、IL-12的mRNA相對(duì)表達(dá)量來對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。

3 發(fā)酵液中多肽產(chǎn)物的分離純化

生物活性肽的分離純化技術(shù)對(duì)生物活性肽序列分析、構(gòu)效關(guān)系研究以及進(jìn)一步臨床應(yīng)用非常重要。常用的分離純化方法有超濾、凝膠過濾層析、陰陽離子交換和HPLC等。一些生物活性肽的序列見表2。

3.1 超濾 超濾是依據(jù)膜截留分子量不同來對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分級(jí)的一種分離技術(shù)，即樣品在一定壓力（一般為0.1～0.5MPa）下被壓入系統(tǒng)，分子量不同的物質(zhì)經(jīng)過膜時(shí)，超過膜體積的大分子物質(zhì)被膜體積截留并再次循環(huán)，小分子物質(zhì)和溶劑作為滲透劑通過膜并被收集，從而達(dá)到分離純化的目的[38]，具有無相變、設(shè)備簡(jiǎn)單，能耗低等優(yōu)點(diǎn)。在生物活性肽的分離過程中，超濾通常最先被應(yīng)用達(dá)到產(chǎn)物分級(jí)的目的。崔云云[39]采用篩選出的產(chǎn)蛋白酶活力最高的Y4菌株發(fā)酵大豆豆粕，發(fā)酵液經(jīng)超濾膜分級(jí)過得到3個(gè)多肽混合液組分F1（10000 Da）、F2（1000 Da）、F3（500 Da）。潘道東[40]采用2種瑞士乳桿菌發(fā)酵牛乳，發(fā)酵液經(jīng)超濾、凝膠層析、HPLC等方法分離純化后，得到的具有抗ACE活性的2個(gè)峰通過序列分析可知，它為Val-Pro-Pro（VPP），峰Ⅱ的序列為Ile-Pro-Pro（IPP）。

3.2 凝膠過濾層析 凝膠過濾層析法又稱為分子篩層析，能夠分離分子量大小不同的分子。網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠有分子篩作用，分子經(jīng)過凝膠多孔結(jié)構(gòu)的流速不同，從而可以將不同分子量的物質(zhì)分開，但對(duì)于分子質(zhì)量接近的物質(zhì)卻不能很好地分離[41]。周永婧[42]通過對(duì)WGH-80%采取葡聚糖凝膠Sephadex G-15S的方式進(jìn)行分離純化，結(jié)果表明，分離得到的第二組分（G2）具有最優(yōu)的促酵母增殖和代謝活性，經(jīng)質(zhì)譜鑒定G2組分中起主要作用的小分子肽則可能是AQP、ENG、LIR、SSR、LIM、LIPPY和PPY。王文江[43]以山杏粕為原料，利用黑曲霉發(fā)酵法制備山杏多肽，利用超濾法將山杏多肽分離為ASP1、ASP2、ASP3及ASP4等4種多肽樣品。利用Sephedax G-25凝膠層析柱對(duì)ASP4多肽樣品進(jìn)行分離純化得到樣品：AASP4、BASP4、CASP4，采用MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)試這3組樣品對(duì)于腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，結(jié)果表明，AASP4樣品的效果更佳，IC50值為2.297mg/mL，而CASP4樣品與BASP4樣品的抑制率較低。

3.3 高效液相色譜 高效液相色譜法是根據(jù)氣相色譜的理論，在經(jīng)典色譜法的基礎(chǔ)上，流動(dòng)相通過高壓輸送，色譜柱用小粒徑的填料填充而成，柱效高于經(jīng)典液相色譜，柱后的高靈敏檢測(cè)器可以對(duì)流出物進(jìn)行連續(xù)的測(cè)定。陳敏[44]采用液態(tài)發(fā)酵法制備抗氧化肽，并采用高效液相色譜等分離技術(shù)對(duì)抗氧化肽實(shí)現(xiàn)了逐級(jí)分離純化，得到的具有最高的DPPH自由基清除率（70.61%，1mg/mL）的組分是SPGPs-2D-2，與分離前相比（67.26%，30mg/mL），提高至少30倍，烏賊生殖腺抗氧化肽得到了有效富集。金晶[45]利用枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵菜籽粕生產(chǎn)菜籽ACE抑制肽，將制備得到的菜籽多肽液通過高效液相色譜等技術(shù)分離，結(jié)果表明，經(jīng)反相液相色譜分離得到較純肽段RDBB，其ACE抑制活性達(dá)到88.9%。

4 展望

生物活性肽是當(dāng)前極具發(fā)展前景的食品功能因子，發(fā)酵法是當(dāng)前生產(chǎn)中多采用的制備方法，發(fā)酵法具有來源廣泛、發(fā)酵產(chǎn)物均勻和風(fēng)味優(yōu)越、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，適合進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。但由于研究基礎(chǔ)較差、生產(chǎn)技術(shù)不完善，產(chǎn)品生產(chǎn)過程中蛋白質(zhì)利用率較低，多肽的含量以及生物活性難以得到保證，并且造成了大量的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。制備工藝的高效性和安全性是實(shí)現(xiàn)生物活性肽產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵因素，隨著研究的不斷深入，將進(jìn)一步解決發(fā)酵法的不可控性和安全問題，為其在生物活性肽領(lǐng)域的進(jìn)一步應(yīng)用打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，為功能性保健食品的開發(fā)提供新原料和新方向，使其今后的研究方向和研究前景更加廣闊。

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（責(zé)編：張宏民）