HPLC法測(cè)定銀黃甘顆粒中金銀花有效成分綠原酸的含量

鄭雪媚

摘 要：目的：采用HPLC法測(cè)銀黃甘顆粒中金銀花有效成分綠原酸的含量。方法：測(cè)定色譜條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（5u4.6×250mm），以乙腈-0.4%磷酸溶液（10∶90）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為327nm。結(jié)果：綠原酸在20～250?g/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2為0.9999;綠原酸的回收率為99.3%～100.5%;綠原酸的測(cè)定重復(fù)性RSD為0.3%。結(jié)論：該方法線性范圍寬，分析時(shí)間短，樣品前處理簡(jiǎn)便，定量結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好。

關(guān)鍵詞：綠原酸;銀黃甘顆粒;HPLC;含量測(cè)定

Abstract： Objective：HPLC determination of chlorogenic acid which is the effective component of honeysuckle in Yinhuanggan Granules. Methods：Determination of chromatographic conditions：column as C18（5u 4.6×250mm），mobile phase as acetonitrile -0.4%Phosphoric acid solution（10∶90，v/v），detection wavelength of 327nm.Results：chlorogenic acid showed a good linear relationship at range of 20～250μg/mL（R2=0.9999）.The recovery rate of chlorogenic acid was 99.3% to 100.5%.The RSD chlorogenic acid was 0.3% .Conclusion：This method showed a wide linear range of the determination，a short analysis time，simple pre-treatment of samples，quantitative results and a good reproducibility.

Key words： Chlorogenic acid; Yinhuanggan Granules; HPLC; Determination of content

金銀花含有綠原酸、異綠原酸、木犀草素、咖啡?？鼘幩犷惖戎饕钚猿煞?，主要藥理作用在于：（1）抗炎作用。王林青等研究發(fā)現(xiàn)，金銀花的提取物對(duì)于大鼠局部急性炎癥有較好的抑制作用[1]。崔曉燕等研究表明，金銀花有效成分能夠顯著抑制大鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞NO釋放，說明其具有抗炎作用[2]。宋建華研究表明，金銀花對(duì)炎癥模型小鼠的抗炎作用與其劑量呈明顯正相關(guān)性[3]。（2）抗菌作用。趙良忠等實(shí)驗(yàn)顯示，金銀花能抑制金黃色葡萄球菌、肺炎雙球菌的繁殖，說明金銀花提取物具有較好抗菌作用[4]。金銀花主要成分綠原酸、異綠原酸、木犀草素均有抑制銅綠假單胞菌的效果，抑制效果最強(qiáng)的是綠原酸;金銀花有機(jī)酸組分與氨基糖苷類抗生素聯(lián)合用藥，能協(xié)同抑制銅綠假單胞菌多耐藥菌株[5]。李平等研究顯示，金銀花對(duì)金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌有不同程度的抑菌效果[6]。李國(guó)喜等實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，金銀花不同濃度水提液可以有效治療人工感染雞大腸桿菌病[7]。（3）抗病毒作用。馬雙成研究發(fā)現(xiàn)，金銀花對(duì)呼吸道病毒有較強(qiáng)的抑制作用，其中綠原酸和咖啡?？鼘幩犷愂瞧淇购粑啦《咀饔玫闹饕钚晕镔|(zhì)[8]。李永梅研究發(fā)現(xiàn)，金銀花醇提取液能增強(qiáng)細(xì)胞抗病毒感染的能力，其抗病毒效果顯著[9]。此外，季志平等研究表明，金銀花能降低病毒感染小鼠的肺指數(shù)值，且明顯減輕感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肺部病變[10]。（4）抗支原體作用。孫艷平等研究發(fā)現(xiàn)，金銀花水提物具有明顯抗肺炎支原體作用[11]。（5）免疫功能調(diào)節(jié)。周秀萍等研究發(fā)現(xiàn)，金銀花水煎劑能明顯提高巨吞噬細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)，其量增加時(shí)，機(jī)體的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率增強(qiáng)[12]。王妍實(shí)驗(yàn)研究證明，金銀花水煎液可提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬功能，同時(shí)也能促進(jìn)小鼠淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，表明金銀花具有明顯免疫調(diào)節(jié)作用[13]。

本研究按照中國(guó)獸藥典要求[14]，根據(jù)綠原酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，建立測(cè)銀黃甘顆粒中綠原酸含量的HPLC法。該方法具有線性范圍寬、分析時(shí)間短、樣品前處理簡(jiǎn)便、定量結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，可為銀黃甘顆粒的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 研究方法

1.1 試劑與儀器 日本島津SPD-20A液相色譜儀;柱溫箱CTO-20AC;超純水儀UPR-5T;超聲波清洗器KQ-500DE;天平METTLER MS105DU;綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品來源：中國(guó)食品藥品檢定研究院;水為超純水，乙腈為色譜純。

1.2 色譜條件 流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸溶液（10∶90），色譜柱：菲羅門C18 5u4.6×250mm，檢測(cè)波長(zhǎng)：327nm，流速：1.0mL/min，柱溫：35℃，進(jìn)樣量：10?L。

1.3 對(duì)照品溶液的配制 稀釋液：流動(dòng)相。對(duì)照儲(chǔ)備液：精密稱取綠原酸對(duì)照品51.9mg，置100mL棕色量瓶中，加50%甲醇使溶解至刻度，搖勻，作為綠原酸對(duì)照品貯備液。取對(duì)照儲(chǔ)備液1.0mL到10mL容量瓶中，加稀釋液定容，制成約51.9?g/mL的對(duì)照液。

1.4 樣品溶液的配制 取銀黃甘顆粒適量，研細(xì)，取約0.5g，精密稱定，置50mL棕色量瓶中，加50%甲醇40mL，超聲處理（功率500W，頻率40kHz）30min，放冷，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取上述51.9?g/mL的對(duì)照溶液10?L分別按1.2。色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)定并計(jì)算柱效、分離度和拖尾因子（具體數(shù)據(jù)見表1）。

1.6 線性試驗(yàn) 取上述對(duì)照儲(chǔ)備溶液分別稀釋成20.05?g/mL、50.14?g/mL、100.27?g/mL、150.41?g/mL、200.54?g/mL、250.68?g/mL的系列對(duì)照品溶液，按1.2色譜條件測(cè)定，以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行回歸，綠原酸峰面積的回歸方程分別為：Y=27136X-102920（R5=0.9999），說明綠原酸在20～250?g/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（具體見圖1）。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，按1.2項(xiàng)色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣6次，得綠原酸峰面積的RSD為0.3%，表明樣品的重復(fù)性良好。具體如表2所示。

1.8 回收率試驗(yàn) 精密取已知含量的同一批樣品（含量為5.1mg/g）約0.25g（共9份）置于50mL容量瓶中，分別加入上述1.3.2項(xiàng)下對(duì)照儲(chǔ)備液1.5mL、2.5mL、3.5mL，按上述1.4項(xiàng)要求處理，進(jìn)樣測(cè)定。樣品綠原酸的平均回收率為99.9%。具體結(jié)果見表3。

1.9 供試品的測(cè)定 取3批樣品及標(biāo)準(zhǔn)溶液，按外標(biāo)法測(cè)定，每批樣品進(jìn)樣2次，計(jì)算樣品中綠原酸含量（圖譜見圖2）。3批樣品的含量測(cè)定結(jié)果分別為4.9mg/g、4.7mg/g、5.0mg/g。

2 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了HPLC法測(cè)銀黃甘顆粒中綠原酸含量的方法，測(cè)定色譜條件為：色譜柱為菲羅門C18 5u4.6×250mm，流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸溶液（10∶90），流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為327nm，在20～250?g/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。該方法具有線性范圍寬、分析時(shí)間短、樣品前處理簡(jiǎn)便、定量結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，為其質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

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