朝鮮當(dāng)歸提取物對(duì)小鼠腦缺血-再灌注損傷神經(jīng)的保護(hù)作用及其機(jī)制*

程永杰，趙子瑞，李曉妮，吉海杰

(1.山西藥科職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系，太原 030031；2.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，太原 030001；3.山西省中醫(yī)藥研究院，太原 030012)

腦卒中是世界范圍內(nèi)威脅公眾健康的疾病之一。缺血性腦卒中病灶由缺血核心區(qū)及周圍缺血半影區(qū)組成；缺血核心區(qū)神經(jīng)元損傷不可逆，而半影區(qū)損傷能夠通過(guò)及時(shí)治療得到挽救[1]。新生血管生成可使阻塞微血管再通，促進(jìn)半影區(qū)損傷神經(jīng)元恢復(fù)[2]。血管生成是由血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和血管生成素1(angiopoietin-1，Ang-1)等調(diào)節(jié)[3]。研究表明，小鼠腦卒中后全身炎癥加劇，可降低血-腦屏障緊密連接[4]。VEGF可促進(jìn)血管生成，抑制缺血神經(jīng)元損傷，還具有抗炎作用[5]。Ang-1是內(nèi)皮細(xì)胞特異性酪氨酸激酶受體Tie-2配體[6]。Ang-1和VEGF聯(lián)合具有協(xié)同作用，促進(jìn)血管生成和新生血管成熟。朝鮮當(dāng)歸(AngelicagigasNakai)為傘形科植物朝鮮當(dāng)歸的根。朝鮮當(dāng)歸主要含紫花前胡素、紫花前胡醇當(dāng)歸酯、7-去甲基軟木花椒素、異紫花前胡內(nèi)酯和紫花前胡醇[7]。朝鮮當(dāng)歸具有一些生物活性，如神經(jīng)保護(hù)、抗炎和抗氧化等[8-9]。然而，朝鮮當(dāng)歸對(duì)血-腦屏障通透性和血管生成影響筆者未見相關(guān)報(bào)道。因此，本研究旨在評(píng)價(jià)朝鮮當(dāng)歸提取物是否通過(guò)調(diào)節(jié)血-腦屏障通透性和血管生成在小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)誘導(dǎo)缺血-再灌注(ischemia/reperfusion，I/R) 損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 雄性清潔級(jí)C57BL/6小鼠，體質(zhì)量25～30 g，自由飲食和飲水，室溫(23±1) ℃。所有動(dòng)物均由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(晉) 2015 -0001。將小鼠通過(guò)隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，分別為假手術(shù)組、模型對(duì)照組和朝鮮當(dāng)歸(10，25，50，100 mg·kg-1)組，每組各9只。

1.2試劑 朝鮮當(dāng)歸(亳州市保華藥業(yè)有限公司)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenylterazolium chloride,TTC)染料(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：00281342)；Ang-1(美國(guó)Santa公司，批號(hào)：SC-319824)；VEGF(美國(guó)Santa公司，批號(hào)：SC-7269)；CAM-1(美國(guó)Santa公司，批號(hào)：SC-7974)；ZO-1(美國(guó)Santa公司，批號(hào)：I0214)；Occludin(美國(guó)Santa公司，批號(hào)：SC-8144)。

1.3方法

1.3.1朝鮮當(dāng)歸提取物的制備 將朝鮮當(dāng)歸根部用純化水煮3 h，通過(guò)雙層濾網(wǎng)過(guò)濾到Whatman濾紙(杭州雷琪實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，型號(hào)：2105-862)上，在真空下濃縮。最終產(chǎn)生的濃縮提取物是29.1%干燥粉末，干燥粉末在4 ℃冰箱中保存，使用前溶解于0.9%氯化鈉溶液中。

1.3.2I/R模型制備 小鼠I/R模型制備方法：1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，然后頸部行正中縱切口，顯微鏡下暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，用絲線結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端和頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，將線栓從小孔插入頸總動(dòng)脈，上升至頸內(nèi)動(dòng)脈，最后到達(dá)大腦中動(dòng)脈，固定線栓，90 min后拔出線栓，最后縫合切開皮膚[10]。I/R手術(shù)成功率約為70%。假手術(shù)組和模型對(duì)照組大鼠手術(shù)步驟一樣，只是不插線栓。小鼠MCAO手術(shù)90 min后分別灌服不同劑量(10，25，50和100 mg·kg-1)朝鮮當(dāng)歸提取物(0.9%氯化鈉溶液溶解)，再灌注24 h后麻醉處死，進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

1.3.3腦梗死體積測(cè)定 再灌注24 h后，迅速將動(dòng)物斷頭取腦，將腦組織置于冰箱-20 ℃冷凍10～15 min，自前腦額極起用鋒利刀片切成冠狀切片，每片厚約1.5 mm，將腦片置于0.5%TTC染色液中，于37 ℃下孵育30 min。腦片用掃描儀掃描，用image pro plus 軟件對(duì)腦片梗死體積進(jìn)行分析[11]。

1.3.4Western blotting分析 再灌注24 h后，通過(guò)試劑盒提取小鼠半影區(qū)總蛋白，取20 μg蛋白行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳分析，電泳后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上。然后分別加入兔抗Ang-1、VEGF、ZO-1和Occludin多克隆抗體(1：1000)和鼠抗……-actin多克隆抗體(1：5000)孵育。再加入山羊抗兔和山羊抗鼠的二抗(1：5000)，室溫孵育。最后用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)，應(yīng)用Quantity one軟件對(duì)吸光度進(jìn)行評(píng)估。

2 結(jié)果

2.1朝鮮當(dāng)歸提取物對(duì)I/R小鼠腦梗死體積影響 采用TTC染色觀察I/R小鼠腦梗死體積變化。模型對(duì)照組相對(duì)腦梗死體積為(29.7±5.2)%。10，25，50和100 mg·kg-1朝鮮當(dāng)歸組小鼠相對(duì)腦梗死體積分別為(31.1±5.6)%，(24.0±3.9)%，(18.5±5.8)% 和(15.8±3.7)%(圖1)。與模型對(duì)照組比較，50和100 mg·kg-1朝鮮當(dāng)歸提取物可以顯著減小腦梗死體積(F=13.84，P<0.01)。

圖1 5組小鼠腦梗死情況(典型TTC 染色圖)

Fig.1Cerebralinfarctioninfivegroupsofmice(representativeimagesofTTCstaining)

2.2朝鮮當(dāng)歸提取物對(duì)I/R小鼠血管生成調(diào)節(jié)蛋白影響 如圖2所示，與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組Ang-1表達(dá)顯著降低(F=19.21，P<0.01)。與模型對(duì)照組比較，25，50 和 100 mg·kg-1朝鮮當(dāng)歸提取物處理后Ang-1(F=19.21，P<0.01)和VEGF(F=22.63，P<0.01)表達(dá)明顯增加。此外，與模型對(duì)照組比較，100 mg·kg-1朝鮮當(dāng)歸處理后p-Akt(F=15.07，P<0.01)和PI3K(F=17.52，P<0.01)表達(dá)明顯增高(圖3)。如圖4所示，與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組ZO-1(F=12.74，P<0.01)和Occludin(F=16.16，P<0.01)表達(dá)顯著降低；朝鮮當(dāng)歸治療后ZO-1表達(dá)明顯增高，呈劑量依賴性(F=17.89，P<0.01)。

A.假手術(shù)組；B.模型對(duì)照組；C.朝鮮當(dāng)歸10 mg·kg-1組；D.朝鮮當(dāng)歸25 mg·kg-1組；E.朝鮮當(dāng)歸50 mg·kg-1組；F.朝鮮當(dāng)歸100 mg·kg-1組；①與假手術(shù)組比較，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，P<0.01。

圖2 6組小鼠Ang-1和VEGF表達(dá)比較

A.sham operation group；B.model control group；C.Angelica gigas Nakai 10 mg·kg-1group；D.Angelica gigas Nakai 25 mg·kg-1group；E.Angelica gigas Nakai 50 mg·kg-1group；F.Angelica gigas Nakai 100 mg·kg-1group;①Compared with sham operation group,P<0.01；②Compared with model control group,P<0.01.

Fig.2 Comparison of the expression of Ang-1 and VEGF among six groups of mice

2.3朝鮮當(dāng)歸提取物對(duì)I/R小鼠血-腦屏障通透性影響 如圖5所示，伊文思蘭染色顯示，與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組血-腦屏障通透性增大(F=48.62，P<0.01)；25，50 和 100 mg·kg-1組血-腦屏障通透性顯著降低(F=48.62，P<0.01)。

3 討論

本研究顯示，朝鮮當(dāng)歸對(duì)I/R小鼠神經(jīng)具有保護(hù)作用。VEGF是血管生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，VEGF促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和存活，使傷口愈合，并在腦損傷修復(fù)中促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖[12]。局灶性腦缺血中檢測(cè)到Ang-1和 Ang-2表達(dá)，Ang-1具有保護(hù)血管通透性作用，還可以激活Tie-2受體，發(fā)揮抗炎作用[13]。PI3K/Akt通路激活Tie-2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使血管血管通透性保持穩(wěn)定；血管生成調(diào)節(jié)因子VEGF和Ang-1不能直接調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，但是通過(guò)PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)[14]。與VEGF不同，Ang-1主要在血管發(fā)育階段發(fā)揮作用，例如血管重塑和成熟。本研究中，朝鮮當(dāng)歸提取物可增加I/R小鼠缺血半影區(qū)VEGF和 Ang1表達(dá)。刺激小鼠腦VEGF和Ang-1 表達(dá)可增加微血管密度，大劑量VEGF和Ang-1聯(lián)合使用促進(jìn)缺血狀態(tài)下血管形成[15]。本研究表明，朝鮮當(dāng)歸促進(jìn)缺血性腦損傷后血管生成，主要是通過(guò)增加VEGF和Ang1的表達(dá)。

A.假手術(shù)組；B.模型對(duì)照組；C.朝鮮當(dāng)歸10 mg·kg-1組；D.朝鮮當(dāng)歸25 mg·kg-1組；E.朝鮮當(dāng)歸50 mg·kg-1組；F.朝鮮當(dāng)歸100 mg·kg-1組；①與假手術(shù)組比較，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，P<0.05；③與模型對(duì)照組比較，P<0.01。

圖3 6組小鼠Akt和PI3K表達(dá)比較

A.sham operation group; B.model control group; C.Angelica gigas Nakai 10 mg·kg-1group; D.Angelica gigas Nakai 25 mg·kg-1group; E.Angelica gigas Nakai 50 mg·kg-1group; F.Angelica gigas Nakai 100 mg·kg-1group; ①Compared with sham operation group,P<0.01 ; ②Compared with model control group,P<0.05；③Compared with model control group,P<0.01.

Fig.3ComparisonoftheexpressionofAktandPI3Kamongsixgroupsofmice

A.假手術(shù)組；B.模型對(duì)照組；C.朝鮮當(dāng)歸10 mg·kg-1組；D.朝鮮當(dāng)歸25 mg·kg-1組；E.朝鮮當(dāng)歸50 mg·kg-1組；F.朝鮮當(dāng)歸100 mg·kg-1組；①與假手術(shù)組比較，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，P<0.01。

圖4 6組小鼠ZO-1和Occludin表達(dá)比較

A.sham operation group; B.model control group; C.Angelica gigas Nakai 10 mg·kg-1group; D.Angelica gigas Nakai 25 mg·kg-1group; E.Angelica gigas Nakai 50 mg·kg-1group; F.Angelica gigas Nakai 100 mg·kg-1group;①Compared with sham operation group,P<0.01 ; ②Compared with model control group,P<0.01.

Fig.4ComparisonoftheexpressionofZO-1andOccludinamongsixgroupsofmice

A.假手術(shù)組；B.模型對(duì)照組；C.朝鮮當(dāng)歸10 mg·kg-1組；D.朝鮮當(dāng)歸25 mg·kg-1組；E.朝鮮當(dāng)歸50 mg·kg-1組；F.朝鮮當(dāng)歸100 mg·kg-1組；①與假手術(shù)組比較，P<0.01；②與模型對(duì)照組比較，P<0.01。

圖5 6組小鼠血-腦屏障通透性比較

A.sham operation group; B.model control group; C.Angelica gigas Nakai 10 mg·kg-1group; D.Angelica gigas Nakai 25 mg·kg-1group; E.Angelica gigas Nakai 50 mg·kg-1group; F.Angelica gigas Nakai 100 mg·kg-1group;①Compared with sham operation group,P<0.01 ; ②Compared with model control group,P<0.01.

Fig.5Comparisonofblood-brainbarrieramongsixgroupsofmice

血-腦屏障是一個(gè)高度復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如卒中、癲、阿爾茨海默病和腦腫瘤與血-腦屏障功能障礙有關(guān)[16]。此外，血-腦屏障損傷有助于繼發(fā)性炎癥和神經(jīng)元損傷，從而促使疾病發(fā)展。在本研究中，朝鮮當(dāng)歸提取物處理減少I/R小鼠血-腦屏障破壞。緊密連接蛋白是血-腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞之間一種有效的屏障。在生理和病理?xiàng)l件下，緊密連接蛋白表達(dá)、亞細(xì)胞定位、翻譯后調(diào)節(jié)和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用會(huì)發(fā)生變化[17]。朝鮮當(dāng)歸提取物促進(jìn)缺血腦組織中ZO-1和Occludin蛋白表達(dá)，呈劑量依賴性關(guān)系。因而朝鮮當(dāng)歸提取物可以有效預(yù)防I/R小鼠血-腦屏障損傷引起的神經(jīng)元損傷。此外，朝鮮當(dāng)歸主要含有紫花前胡素、紫花前胡醇當(dāng)歸酯、7-去甲基軟木花椒素、異紫花前胡內(nèi)酯和紫花前胡醇，均為香豆素類化合物，可抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、白細(xì)胞介素-1和環(huán)氧化酶-2等[18]。由于朝鮮當(dāng)歸具有抗炎作用，也可能在緩解I/R小鼠血-腦屏障損傷引起的神經(jīng)元損傷中發(fā)揮作用。

總之，朝鮮當(dāng)歸可激活PI3K/Akt通路，增加血管生成誘導(dǎo)蛋白Ang-1、VEGF 和緊密連接蛋白ZO-1和 Occludin表達(dá)，因而具有減小I/R引起的腦梗死體積及血-腦屏障通透性等作用。