異甘草素聚乳酸納米粒的制備及在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)*

高青，馬記平

(鄭州澍青醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，鄭州 450064)

異甘草素(isoliquiritigenin)是從中藥材甘草中提取、分離得到的一種異黃酮類化合物，在肉豆蔻、板藍(lán)根、紅血藤等植物中也廣泛存在。具有抗腫瘤、抗氧化、抗心律失常、抗炎、解痙等多種藥理活性[1-2]。但異甘草素水溶性較差，影響了在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。 因此非常有必要采用制劑新技術(shù)對其進(jìn)行研究，開發(fā)出活性更強(qiáng)、毒副作用更小的異甘草素新型制劑。目前已有脂質(zhì)體、微乳等制劑的研究[3-5]。

納米給藥系統(tǒng)是指采用高分子材料作為載體，通過一定的制劑技術(shù)而制備成粒徑在10～1000 nm之間的微粒[6]?？稍黾铀幬锏娜芙舛燃胺€(wěn)定性，促進(jìn)體內(nèi)藥物吸收，實(shí)現(xiàn)被動靶向等。聚乳酸(polylactic acid，PLA)作為可生物降解的一種高分子材料，體內(nèi)最終代謝為水和二氧化碳，被譽(yù)為“綠色材料”，已被美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于醫(yī)用材料和各種藥物制劑的制備。王學(xué)清等[7]以上市產(chǎn)品新山地明(Neoral?)為參比制劑，對環(huán)孢素聚乳酸納米粒在大鼠體內(nèi)生物利用度進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者生物利用度相似，但環(huán)孢素聚乳酸納米粒采用了生物降解材料，與Neoral?比較避免了表面活性劑Gremophor RH40帶來的毒性與變態(tài)反應(yīng)。另外，根據(jù)不同藥物不同的理化性質(zhì)和藥理作用，可通過調(diào)整聚乳酸相對分子質(zhì)量的大小進(jìn)而達(dá)到控制納米粒釋藥速率的目的。邢潔等[8]采用分子質(zhì)量相對較小的聚乳酸制備的冬凌草甲素聚乳酸納米粒，體外釋放速率明顯加快，有助于快速達(dá)到較高的血藥濃度，迅速發(fā)揮鎮(zhèn)痛藥效。戴東波等[9]采用分子質(zhì)量相對較高的聚乳酸制備的鹽酸阿霉素聚乳酸納米粒，體外緩釋特征非常明顯，48 h內(nèi)累積釋放度為55.8%，體內(nèi)藥動學(xué)研究結(jié)果顯示納米粒在體內(nèi)消除顯著減緩，體內(nèi)循環(huán)時(shí)間顯著延長。本研究以聚乳酸為納米載體，制備異甘草素聚乳酸納米粒(isoliquiritigenin-loaded polylactic acid nanopartic-les)，對粒徑分布、Zeta電位、體外釋藥等進(jìn)行研究。與異甘草素混懸液對比，研究異甘草素聚乳酸納米粒體內(nèi)藥動學(xué)行為。為異甘草素研究、開發(fā)提供新的研究策略，也為其他難溶性中藥活性成分提供參考[10]。

1 儀器、試藥與動物

1.1實(shí)驗(yàn)儀器 高效液相色譜儀(安捷倫儀器公司，型號：Agilent 1260，二極管陣列檢測器)；電子天平(賽多利斯精密儀器北京有限公司，型號：SQP，感量：0.1 mg)；渦旋混合器(其林貝爾儀器制造有限公司，型號：VORTEX-5)；超聲儀(寧波新知科儀器研究所，型號：JY92-II)；粒度分析儀(馬爾文科學(xué)儀器有限公司，型號：Master sizer 2000)；氮?dú)獯祾邇x(杭州市奧威儀器有限公司，型號：MD202-3)；高速臺式冷凍離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司，型號：GTR22-1)。

1.2試藥 異甘草素對照品(天津一方科技有限公司，批號：20160824，含量：98.8%)；聚乳酸(山東岱罡科技有限公司，批號：2017021522，相對分子質(zhì)量3000)；poloxamer 188(F68，德國巴斯夫有限公司，批號：T20151205)；甲醇(色譜級)，其他試劑均為分析純。

1.3實(shí)驗(yàn)動物 清潔級SD大鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量(300±20)g，購自河南省動物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(豫)2016-0001。所有大鼠飼養(yǎng)在清潔級實(shí)驗(yàn)環(huán)境，溫度20～24 ℃，濕度40%～55%。

2 方法與結(jié)果

2.1異甘草素含量測定色譜條件 色譜柱：Hypersil ODS C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.5%甲酸溶液(44：56)；波長：372 nm；體積流量：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2異甘草素聚乳酸納米粒包封率和載藥量 取異甘草素聚乳酸納米?；鞈乙?.0 mL，18 000 r·min-1(r=15 cm)離心60 min后，小心吸取上清液液測定游離的異甘草素含量(W游離)。另取異甘草素聚乳酸納米?；鞈乙?.0 mL，加入甲醇超聲破乳后，測定異甘草素總含量(W總)。計(jì)算異甘草素聚乳酸納米粒包封率和載藥量。

包封率(%)=(W總-W游離)/W總×100%；載藥量(%)=(W總-W游離)/W總質(zhì)量×100%。

其中W總為聚乳酸納米粒中異甘草素總量；W游離為聚乳酸納米粒混懸液游離異甘草素量；W總質(zhì)量為聚乳酸納米粒的總質(zhì)量。

2.3異甘草素聚乳酸納米粒制備工藝優(yōu)化

2.3.1異甘草素聚乳酸納米粒的制備工藝 精密稱取異甘草素40 mg和適量聚乳酸溶于30 mL丙酮溶液中(經(jīng)重蒸處理)，攪拌、溶解后緩慢加入到一定體積、適量濃度的poloxamer 188乙醇-水相中。滴加完畢后，于冰浴中超聲15 min。減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除有機(jī)溶劑，濃縮。微孔濾膜濾過，即得異甘草素聚乳酸納米粒。

2.3.2正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化制備工藝 結(jié)合前期異甘草素聚乳酸納米粒單因素實(shí)驗(yàn)考察情況，以包封率為考察指標(biāo)，選擇處方中聚乳酸載體用量(A，mg)，表面活性劑poloxamer 188濃度(B，%)，乙醇-水體積(C，mL)，乙醇-水比例(D)4個(gè)因素為主要影響因素，每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)考察水平，采用L9(34) 正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化異甘草素聚乳酸納米粒的處方，因素水平和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

Tab.1Designandresultsoforthogonaltest

實(shí)驗(yàn)序號聚乳酸載體用量(A)/mgpoloxamer 188濃度(B)/%乙醇-水體積(C)/mL乙醇-水比例(D)/%綜合評分1280(1)0.3(1)40(1)13(1)51.32280(1)0.5(2)50(2)14(2)73.63280(1)0.7(3)60(3)15(3)63.84300(2)0.3(1)50(2)15(3)68.15300(2)0.5(2)60(3)13(1)56.46300(2)0.7(3)40(1)14(2)70.87320(3)0.3(1)60(3)14(2)72.18320(3)0.5(2)40(1)15(3)64.79320(3)0.7(3)50(2)13(1)57.4R162.90063.83362.26755.033R265.10064.90066.36772.167R364.73364.00064.10065.533Rj2.2001.0674.10017.134

根據(jù)表1中極差Rj值，各因素對異甘草素聚乳酸納米粒包封率影響大小順序?yàn)镈>C>A>B。根據(jù)Rn(n為1，2或3)，最佳組合為A2B2C2D2，即聚乳酸用量為300 mg，poloxamer 188濃度為0.5%，乙醇-水體積為50 mL，乙醇-水比例為1：4。根據(jù)方差分析結(jié)果(表2)，因素D即乙醇-水比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。按照優(yōu)化后的處方工藝制備3批異甘草素聚乳酸納米粒，結(jié)果顯示，包封率為(74.94±1.18)%。

表2 方差分析結(jié)果

F0.05(2，2)=19.00；F0.01(2，2)=99.0。

2.4異甘草素聚乳酸納米?；拘再|(zhì)

2.4.1載藥量、粒徑分布及Zeta電位 按照“2.2”項(xiàng)下測定方法，測得異甘草素聚乳酸納米粒載藥量為(8.45±0.66)%。取異甘草素聚乳酸納米?；鞈乙海兓♂?，置于比色池中。測定聚乳酸納米粒粒徑和Zeta電位(圖1，2)。測定結(jié)果顯示，異甘草素聚乳酸納米粒平均粒徑為(190.22±3.09) nm，多分散性指數(shù)(polydispersity index,PDI)為0.149±0.039；Zeta電位為(-12.5±0.27) mV。

圖1 異甘草素聚乳酸納米粒的粒徑分布

Fig.1Particlesizedistributionofisoliquiritigenin-loadedpolylacticacidnanoparticles

圖2 異甘草素聚乳酸納米粒的Zeta電位

Fig.2Zetapotentialofisoliquiritigenin-loadedpolylacticacidnanoparticles

2.4.2異甘草素聚乳酸納米粒體外釋藥行為 取異甘草素原料藥混懸液及其聚乳酸納米粒混懸液2 mL，異甘草素含有量均為2 mg，置于經(jīng)處理好的透析袋中，兩端扎緊。避光操作，以 2.0%十二烷基硫酸鈉溶液150 mL為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速設(shè)置為100 r·min-1，溫度為(37±1)℃。分別在0，0.25，0.5，1，2，3，4，6，8，12，24，36和48 h取外液2.0 mL，及時(shí)補(bǔ)充2.0 mL的空白釋放介質(zhì)。測定各時(shí)間點(diǎn)的藥物含量，并計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的累積釋放度，繪制體外溶出曲線(圖3)。由結(jié)果可知，將異甘草素制備成聚乳酸納米粒后，體外釋藥具有明顯的緩釋釋藥特征。

圖3 異甘草素及其聚乳酸納米粒的體外釋放曲線(n=3)

Fig.3Invitroreleaseprofilesofisoliquiritigeninanditspolylacticacidnanoparticles(n=3)

2.4.3釋藥模型擬合 對異甘草素聚乳酸納米粒體外釋藥分別采用零級、一級、Higuchi及Weibull模型進(jìn)行擬合，研究發(fā)現(xiàn)(表3)，制備的異甘草素聚乳酸納米粒體外釋藥模型符合Weibull模型：LnLn[1/(1-Mt/M∞)]=0.519 4Lnt-1.391 9(r=0.972 8)。

表3 藥物釋放模型和相關(guān)系數(shù)

Tab.3Drugreleasemodelandcorrelationcoefficient

模型擬合方程R2零級模型Mt/M∞=0.021 1t+0.208 40.731 7一級模型Ln[1/(1-Mt/M∞)]=-0.049 8 t-0.251 10.914 6Higuchi模型Mt/M∞=0.139 9 t1/2+0.098 90.941 6Weibull模型LnLn[1/(1-Mt/M∞)]= 0.519 4Lnt-1.39190.972 8

Mt為t時(shí)間累積釋放度；M∞為∞時(shí)累積釋放度；Mt/M∞為t時(shí)間累積釋放百分率；t為時(shí)間。

Mtis accumulative release at time t；M∞is accumulative release at time ∞；Mt/M∞is accumulative release percentage at timet；tis time.

2.5藥動學(xué)研究

2.5.1血漿樣品的處理 精密量取血漿樣品100 μL和內(nèi)標(biāo)溶液50 μL置于具塞尖底離心管中，加入甲醇1.5 mL，以沉淀蛋白，渦旋混合4 min，8000 r·min-1離心15 min(r=7.7 cm)。轉(zhuǎn)移上清液，40 ℃氮?dú)獯蹈捎袡C(jī)溶劑。殘留物加入100 μL流動相復(fù)溶，8000 r·min-1離心10 min(r=7.7 cm)，后進(jìn)高效液相色譜儀測定藥物含量[11-12]。

2.5.2對照品溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 配制濃度為10 μg·mL-1異甘草素對照品溶液，進(jìn)一步稀釋、配制濃度分別為50.0，100.0，250.0，500.0和1000.0 ng·mL-1的系列異甘草素的血漿樣品。另精密配制濃度為200 ng·mL-1苯甲酸鈉內(nèi)標(biāo)溶液。以異甘草素和苯甲酸鈉峰面積比(Y)與異甘草素濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得出線性回歸方程為Y=0.060 7X+0.021 4(r=0.999 3)。由相關(guān)系數(shù)r可知，在50.0～1000.0 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.3方法學(xué)驗(yàn)證 以異甘草素的低(50.0 ng·mL-1)、中(500.0 ng·mL-1)、高(1000.0 ng·mL-1)濃度考察日內(nèi)精密度RSD值。結(jié)果顯示RSD值分別為7.28%，4.36%和5.11%(n=3)。考察5 d的日間精密度，3種濃度RSD值分別為10.53%，6.80%和7.74%(n=3)。取大鼠空白血漿100 μL，分別配制低、中、高濃度的異甘草素血漿溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理。由回歸曲線求出測定濃度，與實(shí)際濃度比較。結(jié)果顯示3種濃度的回收率分別為89.61%，93.57%和92.94%(n=3)。其中，3種濃度的RSD值<7.11%。任取一份血漿樣品，置于-20 ℃冰箱中于5 d內(nèi)反復(fù)融凍，高效液相色譜(HPLC)測定血藥濃度變化，結(jié)果顯示，血藥濃度的變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。因此，血漿樣品5 d內(nèi)反復(fù)融凍時(shí)穩(wěn)定性較好。

2.5.4給藥方案及樣品采集 取SD大鼠隨機(jī)分為2組，每組6只。實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)2 d，禁食，自由飲水。按60 mg·kg-1灌胃異甘草素原料藥混懸液和異甘草素聚乳酸納米粒混懸液。分別于0，0.5，0.75，1，1.5，2，3，4，6，8，10和12 h各時(shí)間點(diǎn)眼眶采血約0.3 mL，置于肝素化處理后的離心管中。以轉(zhuǎn)速為3500 r·min-1離心2 min。分取上層血漿，于-20 ℃冰箱冷凍保存，測定前復(fù)溶[10-11]。

2.5.5藥動學(xué)曲線及主要參數(shù) 分別測定異甘草素及其聚乳酸納米粒血漿樣品血藥濃度，繪制藥動學(xué)曲線。達(dá)峰濃度(Cmax)和達(dá)峰時(shí)間(tmax)采用實(shí)測值，藥物濃度-時(shí)間曲線下面積(AUC)采用梯形法計(jì)算。藥動學(xué)曲線結(jié)果見圖4及表4。異甘草素聚乳酸納米粒tmax提前，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Cmax由(436.86±90.46) ng·mL-1顯著提高至(750.55±109.36) ng·mL-1；t1/2由(2.34±0.55) h延長至(3.81±0.72) h，表明聚乳酸納米粒顯著提高了藥物在體內(nèi)循環(huán)時(shí)間；AUC0-t由(1449.13±233.41) ng·mL-1·h極顯著提高至(2463.88±408.17) ng·mL-1·h，口服吸收生物利用度提高至170.02%。

圖4 異甘草素及其聚乳酸納米粒的平均藥物濃度-時(shí)間曲線(n=6)

Fig.4Meanplasmaconcentration-timecurvesofisoliquiritigeninanditspolylacticacidnanoparticles(n=6)

3 討論

異甘草素聚乳酸納米粒系采用改良的自乳化溶劑擴(kuò)散法進(jìn)行制備，推測形成納米粒的過程為：在攪拌的條件下，將溶有異甘草素和載體的油相加入到含乳化劑的水相中，水溶性溶劑自發(fā)擴(kuò)散，大大降低了兩相之間的表面張力，同時(shí)產(chǎn)生界面騷動，最終形成納米級別的乳滴。隨著有機(jī)溶劑的不斷揮發(fā)，納米級別乳滴從水相中逐漸析出。由于異甘草素分子結(jié)構(gòu)中有3個(gè)羥基與苯環(huán)直接相連，具有較強(qiáng)的極性，容易與聚乳酸分子結(jié)構(gòu)中羰基形成氫鍵[13-14]，增強(qiáng)了兩者的親和力，乳滴固化后成為聚乳酸納米粒?？梢钥闯?，載體和藥物能否從水相中同步析出，是影響包封率的影響因素之一。由于載體聚乳酸在乙醇不溶，而在丙酮溶解度較好。在丙酮體積不變的情況下，通過調(diào)整乙醇有機(jī)溶劑的比例，進(jìn)而使載體和藥物能近乎同步從水相中析出形成納米粒。這也解釋了正交實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果中乙醇-水比例對異甘草素聚乳酸納米粒包封率具有極顯著性差異的原因。劉月新等[15]制備的吡喹酮聚乳酸納米粒包封率僅為46.74%，這可能與有機(jī)溶劑(丙酮/乙醇)比例不合適有關(guān)。因此，除了藥物/載體比、油相/水相體積比、表面活性劑濃度等因素會影響聚乳酸納米粒包封率外[15-16]，有機(jī)溶劑的比例也是需要重點(diǎn)考察的因素之一。本研究對高包封率的聚乳酸納米粒的研究有一定的借鑒意義[17]。

表4 異甘草素及其聚乳酸納米粒的主要藥動學(xué)參數(shù)

Tab.4Mainpharmacokineticparametersofisoliquiritigeninanditspolylacticacidnanoparticles

項(xiàng)目tmaxt1/2hCmax/(ng·mL-1)AUC0-tAUC0-∞(ng·mL-1·h)異甘草素2.08±0.312.34±0.55436.86±90.461449.13±233.411576.06±245.36異甘草素聚乳酸納米粒1.67±0.343.81±0.72①750.55±109.36①2463.88±408.17①2603.43±431.70①

①與異甘草素原料藥比較，t=0.000 439，0.000 812，0.001 547，0.004 284，P<0.01。

①Compared with crude isoliquiritigenin，t=0.000 439，0.000 812，0.001 547，0.004 284，P<0.01.

制備的異甘草素聚乳酸納米粒粒徑分布均勻，體外釋藥模型符合Weibull模型。體內(nèi)藥動學(xué)顯示，聚乳酸納米粒使異甘草素的Cmax顯著提高；AUC0-t顯著提高，口服吸收生物利用度明顯提高，為異甘草素的藥理活性提高奠定基礎(chǔ)。本研究成功制備了粒徑較小、包封率較高、帶負(fù)電荷性質(zhì)的聚乳酸納米粒，為進(jìn)一步研究異甘草素聚乳酸納米粒結(jié)構(gòu)修飾[18-20]，提高腫瘤靶向效果等奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)[21]。