卿煜維，楊劍，趙玲艷，鄧放明

1(湖南農(nóng)業(yè)大學 食品科技學院，湖南 長沙，410128) 2(湖南農(nóng)業(yè)大學，食品科學與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙，410128)

剁辣椒是湖南地區(qū)的一種特色美食，自然發(fā)酵剁辣椒主要是利用辣椒表面天然附著的乳酸菌進行發(fā)酵，使其具有酸、香、辣的特點[1]。目前工業(yè)化生產(chǎn)剁辣椒普遍采用高鹽腌制辣椒的加工方法,產(chǎn)品缺少傳統(tǒng)發(fā)酵剁辣椒特有的風味,而且加工前要脫鹽處理,對環(huán)境造成嚴重污染[2]。韓俊燕等[3]研究發(fā)現(xiàn)，自然發(fā)酵剁辣椒中以魏斯氏菌、明串珠菌和乳桿菌為主要發(fā)酵菌。葉陵等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵過程中接種發(fā)酵能使乳酸菌迅速增值,較快地降低剁辣椒的pH值，抑制致病菌的生長。因此,乳酸菌接種發(fā)酵剁辣椒成為剁辣椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展的熱點問題。

在發(fā)酵肉制品生產(chǎn)過程中硝酸鹽和亞硝酸鹽是一種重要的食品添加劑，可以有效抑制肉毒桿菌的生長[5]。果蔬發(fā)酵中，發(fā)酵初期體系pH值較高，硝酸鹽還原菌大量繁殖，使蔬菜中的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，生成亞硝峰[6]。翟磊等[7]研究發(fā)現(xiàn)，隨著辣椒發(fā)酵時間的增加,亞硝酸鹽的含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,發(fā)酵第2天亞硝酸鹽的含量達到峰值,自然發(fā)酵辣椒中亞硝酸鹽含量為6.5 mg/kg。李羅明等[8]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵辣椒pH達到4時，接種發(fā)酵樣品亞硝酸鹽含量小于1 mg/kg自然發(fā)酵辣椒亞硝酸鹽含量為15 mg/kg。亞硝酸鹽含量超過安全范圍可能會對人體造成危害,短期過量攝入會造成多種疾病,如高鐵血紅蛋白癥、嬰兒先天畸形[9-10]等。人體長期攝入亞硝酸鹽也會產(chǎn)生一系列健康風險，過量的亞硝酸鹽能夠與食物中的生物胺相互作用，在消化道中轉(zhuǎn)化為亞硝胺，具有強致癌作用[10]。

乳酸菌是發(fā)酵糖產(chǎn)生乳酸的一類無芽孢、革蘭氏陽性細菌的總稱[11]，許多研究表明乳酸菌在食品發(fā)酵過程中具有很好的降亞硝酸鹽作用。乳酸菌代謝產(chǎn)物亞硝酸還原酶和乳酸，可降解和清除亞硝酸鹽，抑制硝酸鹽還原菌的生長[12]。李羅明等[13]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵辣椒pH值達到4時，自然發(fā)酵辣椒亞硝酸鹽含量為15 mg/kg，而接種發(fā)酵樣品亞硝酸鹽含量小于1 mg/kg。目前乳酸菌降解亞硝酸酸鹽研究主要集中在植物乳桿菌[14]、短乳桿菌[15]、發(fā)酵乳桿菌[16]、鼠李糖乳桿菌[17]等。張興吉等[18]從西部傳統(tǒng)發(fā)酵乳品中篩選出8株降解亞硝酸鹽優(yōu)勢菌株，其中植物乳桿菌、副干酪乳桿菌、短乳桿菌顯示出穩(wěn)定高效的亞硝酸鹽降解能力。遲雪梅等[19]對常見乳酸菌降解亞硝酸鹽發(fā)酵性能評價發(fā)現(xiàn)，副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、短乳桿菌具有高效降解亞硝酸鹽的能力,其中副干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌在酶降解階段能力較強,但由于該菌產(chǎn)酸較快,使其迅速進入酸降解階段,而抑制亞硝酸鹽降解速率;由于短乳桿菌異型發(fā)酵，產(chǎn)酸能力較弱，pH維持較高水平，亞硝酸鹽還原酶能持續(xù)快速分解亞硝酸鹽。

本研究主要從湖南地區(qū)發(fā)酵剁辣椒中選育生長、產(chǎn)酸速率快，具有亞硝酸鹽降解能力的優(yōu)良乳酸菌并對篩選菌株進行鑒定。研究乳酸菌生長曲線、產(chǎn)酸速率、降低亞硝酸鹽能力、糖酵解等生物學特性，為日后將其應(yīng)用于發(fā)酵辣椒工業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 辣椒樣品

在湖南長沙、岳陽、瀏陽、婁底4個地區(qū)，采集12份傳統(tǒng)發(fā)酵剁辣椒。采用無菌金屬藥勺取樣，并放入滅菌后的100 mL離心管內(nèi)，密封存放于低溫采樣箱中，24 h內(nèi)送回試驗室。

1.1.2 試劑

亞硝酸鈉、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、硼酸、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、NaCl、HCl，國藥集團化學試劑有限公司；革蘭氏染色試劑盒、生理生化鑒定管，北京陸橋技術(shù)有限公司；MC培養(yǎng)基，廣州環(huán)凱微生物科技有限公司；MRS培養(yǎng)基，青島海博生物科技有限公司。

1.2 儀器

ULTS1368醫(yī)用低溫冰箱，賽默飛世爾儀器有限公司；SPL-250生化培養(yǎng)箱，萊玻特儀器設(shè)備有限公司；HCB-1300V潔凈工作臺，海爾生物醫(yī)藥有限公司；PHS-2F型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；UV-1801紫外/可見分光光度計，北分瑞利分析儀器有限責任公司；BIOFLO?120發(fā)酵罐，Eppendorf有限公司;SX-4-10型箱式電阻爐，天津泰斯特儀器有限公司；Olympus BH-2光學顯微鏡，奧林巴斯有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌的分離與純化

分別稱取12份剁辣椒樣品各10 g,使用勻漿機勻漿，在無菌條件下加入90 mL無菌生理鹽水,4 ℃保存?zhèn)溆谩⑸鲜鰳悠废♂屢合♂?03倍后，取0.2 mL涂布于MC固體培養(yǎng)基中,裝入?yún)捬醮?7 ℃條件下厭氧培養(yǎng)48 h后,挑取具有溶鈣圈的單菌落，在MRS瓊脂培養(yǎng)基上重復(fù)分離純化3次，挑取單個菌落進行革蘭氏染色與過氧化氫酶試驗，革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶試驗陰性則初步鑒定為乳酸菌。將分離純化后菌株置于MRS液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳代2代后加入20%甘油,放入-80 ℃冰箱進行保藏并編號。

1.3.2 降解亞硝酸鹽乳酸菌初篩

1.3.2.1 菌株培養(yǎng)

將菌種接種到MRS液體培養(yǎng)基中傳代活化3次?；罨蟮木N按1%接種量接種到添加了250 mg/L亞硝酸鈉的MRS培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.3.2.2 亞硝酸鹽測定方法

參照文獻[20-21]測定乳酸菌降解亞硝酸鹽的方法并進行改良。菌株振蕩培養(yǎng)24 h后,取0.1 mL菌液置于10 mL離心管中,依次加入0.5 mL飽和硼砂溶液、0.2 mL 106 g/L亞鐵氰化鉀溶液、0.2 mL 220 g/L乙酸鋅溶液,然后加入9 mL超純水,混勻,于4 000×g離心10 min。取5 mL上清液加入10 mL比色管中,加入1 mL對氨基苯磺酸溶液,搖勻,避光靜置5 min,再加入0.5 mL 鹽酸萘乙二胺溶液,超純水定容至10 mL,搖勻,避光靜置10 min。于538 nm波長處測定吸光度，繪制標準曲線并計算亞硝酸鹽含量。

1.3.3 菌種鑒定

1.3.3.1 生理生化鑒定

生理生化試驗包括過氧化氫酶試驗、硫化氫試驗、吲哚試驗、葡萄糖產(chǎn)氣試驗、糖發(fā)酵試驗、產(chǎn)黏性試驗、VP試驗、硝酸鹽還原試驗。參照《伯杰細菌鑒定手冊》[22]與《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[23]對菌株進行初步鑒定。

1.3.3.2 分子生物學鑒定

挑取在MRS固體培養(yǎng)基上純化后的乳酸菌菌落，采用DNA提取試劑盒提取DNA，并對菌株的16S rDNA進行PCR擴增。上游引物 27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物 1495R:5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。PCR擴增條件：98℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性35 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃再延伸4 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至上海派森諾生物工程有限公司進行測序。將測定的序列用 BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)在GenBank數(shù)據(jù)庫中與已知細菌的16S rRNA基因片段序列進行比較，確定菌種種屬地位。然后從GenBank數(shù)據(jù)庫中，下載已知乳酸菌屬標準菌株的16S rRNA基因序列，應(yīng)用MEGA 7.0軟件,采用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.4 生長曲線測定

將菌種接種到MRS液體培養(yǎng)基中傳代活化3次?；罨蟮木N按1%接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，每隔2 h測定其OD600值，每個菌株重復(fù)3次實驗。

1.3.5 產(chǎn)酸能力的測定

將菌種接種到MRS液體培養(yǎng)基中傳代活化3次。活化后的菌種按1%接種量接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h,每隔2 h測定其pH值，每個菌株重復(fù)3次實驗。

1.3.6 亞硝酸鹽降解速率測定

將菌種接種到MRS液體培養(yǎng)基中傳代活化3次?；罨蟮木N按1%接種量接種到亞硝酸鹽液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)72 h,每隔24 h測定其亞硝酸鹽含量，每個菌株重復(fù)3次試驗。

1.3.7 發(fā)酵罐恒定pH發(fā)酵降解亞硝酸鹽試驗

將菌種接種到MRS液體培養(yǎng)基中傳代活化3次。活化后的菌種按1%接種量接種到發(fā)酵罐中，用濃度為2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，使其恒定pH值為6.0。在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h,每隔4 h取樣，測定亞硝酸鹽含量，并與空白組及對照組進行對比?？瞻捉M：調(diào)節(jié)MRS液體培養(yǎng)基初始pH為6.0，不接種乳酸菌。對照組：調(diào)節(jié)MRS液體培養(yǎng)基初始pH為6.0，按1%接種量接種乳酸菌，但不調(diào)節(jié)pH。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有實驗均重復(fù)3次,然后利用SPSS 20進行顯著性分析、Excel 2018計算平均值和標準差、Origin 8.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離結(jié)果

經(jīng)MC瓊脂培養(yǎng)基涂布分離、革蘭氏染色、過氧化氫酶試驗，共分離得到革蘭氏陽性、過氧化氫酶試驗陰性、有溶鈣圈的乳酸菌33株。其中長沙地區(qū)分離出6株，編號為Z1-1～Z1-6。婁底地區(qū)分離出9株，編號為X14-1～X14-9。瀏陽地區(qū)分離出15株，編號為L13-1～L13-15。岳陽地區(qū)分離出2株，編號為H3D與H3X。

2.2 降解亞硝酸鹽乳酸菌初篩

將純化后的33株乳酸菌菌株傳代活化3次,加入含250 mg/L NaNO2的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng),37 ℃培養(yǎng)24 h后測定亞硝酸鹽降低情況。如圖1所示,乳酸菌X14-7、Z1-6、L13-13、H3D亞硝酸鹽降低率較強，分別為87.7%、80.9%、86.3%和79.3%。所以選擇降解亞硝酸鹽能力最強的4株乳酸菌進行后續(xù)試驗。

2.3 篩選乳酸菌形態(tài)學鑒定

菌株H3D菌落形態(tài)為圓形、凸起、乳白色不透明狀，菌株X14-7菌落形態(tài)為圓形、凹起、灰白色透明狀，菌株Z1-6菌落形態(tài)為圓形、扁平、乳白色不透明狀，菌株L13-13菌落形態(tài)為圓形、凸起、乳白色不透明狀。四株乳酸菌革蘭氏染色鏡檢細胞形態(tài)結(jié)果見圖2。

2.4 乳酸菌生理生化鑒定

生理生化鑒定結(jié)果顯示:4株分離株均不能使明膠液化、不產(chǎn)H2S、不能水解淀粉；吲哚試驗、VP試驗、硝酸鹽還原試驗均為陰性。綜上,可初步判定4株菌為乳桿菌屬。對其進行糖發(fā)酵實驗、產(chǎn)黏試驗以及葡萄糖產(chǎn)氣試驗，結(jié)果見表1。經(jīng)鑒定H3D為植物乳桿菌，X14-7為德氏乳桿菌，Z1-6為短乳桿菌，L13-13為戊糖乳桿菌。

注:“+”代表反應(yīng)為陽性,“-”代表反應(yīng)為陰性

2.5 篩選乳酸菌16S rDNA基因序列分析

將純化后的乳酸菌低溫送至派森諾生物科技公司提取基因組，以通用引物對 (27F/1492R) 對菌株16S rDNA序列進行擴增。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化，檢驗合格后進行測序。測序結(jié)果與NCBI中的GenBank數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對,采用MEGA7軟件中的鄰接法 (neighbour-joining,NJ) 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株H3D與植物乳桿菌L.plantarumJCM 1149(登錄號:NR_115605.1)相似性為99%；菌株Z1-6與短乳桿菌L.brevisATCC 14869 (登錄號:NR_044704.2)相似性為99%；菌株X14-7與德氏乳桿菌L.delbrueckiiATCC 9649 (登錄號:NR_115132.1)相似性為99%；菌株L13-13與戊糖乳桿菌L.pentosus124-2 (登錄號:CP026743.1)相似性為100%。菌株H3D、L13-13與植物乳桿菌、戊糖乳桿菌位于一個分支,但H3D與植物乳桿菌親緣性更近，單獨位于一個小分支;菌株Z1-6與短乳桿菌親緣關(guān)系最近；菌株X14-7與德氏乳桿菌親緣關(guān)系最近;結(jié)合生理生化鑒定結(jié)果，進一步確定菌株H3D為植物乳桿菌，Z1-6為短乳桿菌，X14-7為德氏乳桿菌，L13-13為戊糖乳桿菌。

2.6 篩選乳酸菌生長曲線測定

由圖4和圖5可知,乳酸菌H3D、X14-7、L13-13培養(yǎng)2 h后進入對數(shù)生長期,12 h時進入穩(wěn)定期；乳酸菌Z1-6在培養(yǎng)2 h后進入對數(shù)期，20 h時進入穩(wěn)定期；乳酸菌pH值隨時間增加逐漸減小。其中乳酸菌L13-13的產(chǎn)酸能力最強,發(fā)酵液的pH值可達3.49；乳酸菌X14-7產(chǎn)酸速率最快，發(fā)酵12 h其pH下降至4.12，可有效抑制腐敗菌的生長。

由此可知,在低鹽發(fā)酵蔬菜生產(chǎn)中,乳酸菌X14-7具有作為直投式發(fā)酵菌種的潛力。乳酸菌Z1-6由于其生長速率與產(chǎn)酸較慢，同時生理生化鑒定葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)氣試驗為陽性，可推斷乳酸菌Z1-6為異性發(fā)酵乳酸菌，可在果蔬發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量CO2抑制好氧菌的生長。

2.7 篩選乳酸菌亞硝酸鹽降解速率測定

研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌降解亞硝酸鹽分為2個階段，發(fā)酵前期以酶降解為主，發(fā)酵后期pH小于4時以酸降解為主[24-25]。由圖6可知,發(fā)酵期間各菌株亞硝酸鹽培養(yǎng)基中硝酸鹽殘留量逐漸降低。發(fā)酵前4 h亞硝酸鹽降解速率較慢,此時乳酸菌處于遲緩期，培養(yǎng)基中乳酸菌數(shù)量與酸濃度都較低。發(fā)酵4～12 h亞硝酸鹽降解速率加快，此時乳酸菌進入生長對數(shù)期，培養(yǎng)基pH值大于4，亞硝酸鹽以酶降解為主，乳酸菌H3D、X14-7、Z1-6、L13-13降解率分別為48.9%、74.4%、58.5%、48.9%。發(fā)酵12 h后pH值下降到4以下，此時以酸降解為主，亞硝酸鹽降解速率降低，其原因可能是亞硝酸鹽濃度降低同時較低的pH抑制亞硝酸鹽還原酶的活性[26]。發(fā)酵72 h時，培養(yǎng)基中亞硝酸鹽殘留量分別為9.7%、1.5%、16.1%、7.7%。實驗結(jié)果表明，乳酸菌X14-7前12 h亞硝酸鹽降解率顯著高于其余3株乳酸菌且發(fā)酵72 h亞硝酸鹽殘留最少。因此,選擇菌株X14-7作為后續(xù)試驗所用菌。

2.8 X14-7乳酸菌發(fā)酵罐恒定pH值降解亞硝酸鹽速率

由圖7可知，37 ℃培養(yǎng)24 h，空白組培養(yǎng)基中亞硝酸鹽含量基本維持不變，實驗組在發(fā)酵罐中維持pH 為6.0，消除了酸對亞硝酸鹽的降解作用后,降解速率顯著高于正常發(fā)酵組(P<0.05),發(fā)酵24 h后亞硝酸鹽殘留量僅為1.1%，其原因可能是乳酸菌在pH為6.0時最大菌密度高于正常發(fā)酵組且亞硝酸鹽降解酶未受到酸性條件的抑制。

由此可推測X14-7對亞硝酸鹽的降解不只是酸降解的作用,還可能存在其他亞硝酸鹽降解途徑,包括異硝化作用與酶降解等。

3 結(jié)論與討論

發(fā)酵剁辣椒是湖南地區(qū)十分受歡迎的食品，也是乳酸菌菌種重要來源之一。趙玲艷等[27]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵剁辣椒中存在植物乳桿菌、類腸膜魏斯氏菌、戊糖乳桿菌、干酪乳桿菌、戊糖片球菌、短乳桿菌等數(shù)十種乳酸菌。因此，對發(fā)酵辣椒中優(yōu)良菌種進行篩選具有重要意義。本研究從湖南長沙、岳陽、瀏陽、婁底4個地區(qū)采集12份傳統(tǒng)發(fā)酵剁辣椒，共分離出33株乳酸菌,通過對亞硝酸鹽降解能力初篩,形態(tài)觀察、生理生化鑒定及分子生物學技術(shù),最后鑒定菌株H3D、X14-7、Z136、L13-13分別為植物乳桿菌、德氏乳桿菌、短乳桿菌、戊糖乳桿菌。

亞硝酸鹽是一種在發(fā)酵食品中常見有害物質(zhì)，對人體健康具有潛在危害。研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌能通過產(chǎn)生乳酸或亞硝酸鹽還原酶抑制亞硝酸鹽的形成。張慶芳等[24]認為乳酸菌對亞硝酸鹽的降解分為NiR降解和酸降解2個階段。p H>4.5時,乳酸菌對亞硝酸鹽降解以酶降解為主；pH<4.0后,亞硝酸鹽的降解主要以酸降解為主。但發(fā)酵蔬菜形成亞硝峰的時間主要在發(fā)酵前期，因此選育出高效酶降解亞硝酸鹽的乳酸菌對保障發(fā)酵蔬菜食品安全十分重要。本實驗中菌株X14-7具有很強的亞硝酸鹽降解能力,發(fā)酵24 h亞硝酸鹽降解率為87.7%。發(fā)酵罐恒定發(fā)酵試驗表明菌株X14-7在pH 6.0的條件下發(fā)酵24 h其亞硝酸鹽降解率為98.9%，這一現(xiàn)象表明乳酸菌X14-7降解亞硝酸鹽的途徑可能包含除酸降解以外的其他途徑，而乳酸菌酶降解研究主要集中在短乳桿菌、植物乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌等。目前研究尚未報道德氏乳桿菌具有亞硝酸還原酶基因，因此德氏乳桿菌酶降解代謝通路需進一步確認。同時乳酸菌X14-7遲緩期短，生長速率、產(chǎn)酸速率、亞硝酸鹽降解快，能有效抑制發(fā)酵蔬菜發(fā)酵前期腐敗菌的生長以及亞硝酸鹽含量，提高發(fā)酵蔬菜食品安全性，具有較大的開發(fā)潛力。