曾智娟，鄧杰,2，任志強,2，張?zhí)m蘭，車路萍，衛(wèi)春會,2*，黎仲冰

1(四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓，644000) 2(釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川 宜賓，644000) 3(中國人民解放軍原濟南軍區(qū)新技術(shù)農(nóng)副業(yè)生產(chǎn)基地，山東 鄒城，273517)

梨營養(yǎng)豐富，口味極佳[1]，近年來，梨產(chǎn)量不斷增大，據(jù)中國農(nóng)產(chǎn)品年鑒顯示，2017年梨產(chǎn)量達 1 641萬t，位居全國水果產(chǎn)量第三，全世界梨產(chǎn)量第一。但梨果面臨保鮮時間短、運輸困難、深加工途徑少等問題，希望通過加工梨成酒的方式增加其深加工途徑，減緩梨果滯銷現(xiàn)狀，對國家扶貧攻堅政策給予支持。

生姜梨酒是以梨、生姜為原料經(jīng)破碎、榨汁等處理后按照一定配比混合發(fā)酵的新型果酒[2]。其汲取梨中豐富的維生素和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，又汲取生姜中的姜油酮和辛辣成分，既融合了梨生津、清熱、潤燥的功效，又融合了生姜驅(qū)寒、和胃、祛風(fēng)的功效，具有增強人體內(nèi)分泌、提高免疫功能、抗氧化等作用。生姜梨酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的香氣成分、酒精度、有機酸等決定著果酒風(fēng)味及口感。關(guān)于梨酒的研究，目前主要集中在梨品種對比[3]，發(fā)酵工藝的優(yōu)化[4-5]、酵母種類的篩選[6-7]、梨酒香氣成分[8-9]等方面研究，但由于大多發(fā)酵采用葡萄酒酵母釀造，缺乏專用梨酒釀酒酵母，這制約了高品質(zhì)生姜梨酒生產(chǎn)。

本研究利用由實驗室篩選的5種不同酵母菌種及產(chǎn)香酵母和產(chǎn)酒精酵母的復(fù)配來發(fā)酵生姜梨酒，研究酵母菌種對生姜梨酒品質(zhì)的影響，通過測定其酒精度、糖度、酸度等理化指標(biāo)，感官評定、對其香味成分的分析，最終選出適合生姜梨酒發(fā)酵的最優(yōu)酵母及組合，以期釀造出高品質(zhì)的生姜梨酒，為其發(fā)酵加工提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雪花梨、生姜、白砂糖、土豆，市售；Yeast-W2、Yeast-全興5#、Yeast-NJSYS-70、異常畢赤酵母(Pichiaanomala)，釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室提供；安琪果酒酵母，湖北安琪果酒酵母股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MJ-25BM05C榨汁機，廣東美的精品電器有限公司；WYT-ⅡA手持式糖量計折射儀、7890A-5975B氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司；HT300A固相微萃取儀，意大利HTA公司；XMT-100C恒溫培養(yǎng)箱，重慶市永生實驗儀器廠；Bioflo310型發(fā)酵罐，美國NBS公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 生姜梨酒生產(chǎn)工藝流程

1.3.2 操作要點

選取雪梨去皮破碎成汁后，加入0.1%的抗壞血酸、0.2%的檸檬酸進行護色處理，加入新鮮老姜片，生姜梨汁質(zhì)量比1∶30[10]，加90 mg/L偏重亞硫酸鉀進行SO2處理，調(diào)整糖度到21%，8%的接種量，28 ℃恒溫靜置培養(yǎng)，發(fā)酵時間為8 d，測定酒精度、還原糖、總酯等指標(biāo)，并進行感官品評評定和GC-MS檢測。

1.3.3 試驗方法設(shè)計

單一酵母發(fā)酵實驗設(shè)計：將Yeast-W2(編號為A)、Yeast-全興5#(編號為B)、Yeast-NJSYS-70(編號為C)、Pichia anomala(編號為D)、安琪果酒酵母(編號為E)以9%的接種量分別接入發(fā)酵液中，待發(fā)酵結(jié)束后進行感官評定、理化指標(biāo)測定和風(fēng)味物質(zhì)分析。

復(fù)合酵母發(fā)酵試驗設(shè)計：以產(chǎn)酒精酵母(B、E)和產(chǎn)香酵母(A、C、D)兩兩組合進行混菌發(fā)酵生產(chǎn)生姜梨酒，以所得梨酒的理化指標(biāo)和感官評價綜合分值作為依據(jù)，確定最佳發(fā)酵酵母組合。

1.3.4 測定方法

理化指標(biāo)檢測：酒精度、還原糖、總酸參照《葡萄酒、果酒通用分析方法》(GB/T 15038—2006)執(zhí)行；酒精度以酒精計法測定；總酸以酸堿滴定法測定，以蘋果酸計(g/L)；還原糖以直接滴定法測定，以葡萄糖計(g/L)；總酯參照《白酒分析方法》 GBT 10345—2007，以酸堿中和法測定。

感官指標(biāo)品評：選取10位具有品酒經(jīng)驗的師生，參照GB/T—15038《葡萄酒、果酒通用分析方法》，從外觀、香氣、口感等方面評價酒樣。具體評定標(biāo)準(zhǔn)見表1，最終結(jié)果制成感官雷達圖。

1.3.5 生姜梨酒風(fēng)味物質(zhì)氣相色譜-質(zhì)譜 (GC-MS)檢測方法

氣相色譜條件：毛細管色譜柱為DB-WAX，規(guī)格為60 mm×250 μm×0.25 μm；不分流進樣，進樣口溫度為230 ℃；升溫程序：40 ℃保持1 min，然后5 ℃/min升溫到180℃，保持1 min，再8 ℃/min升溫到230 ℃，保持7 min；載氣：99.999% He，流速為1 mL/min。質(zhì)譜條件：EI電離源，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍20～500 u，離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，接口溫度230 ℃，溶劑延遲3 min[11]。

定性分析：根據(jù)總離子流圖檢測出揮發(fā)性組分的質(zhì)譜圖，通過與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(NIST05a.L)對比鑒定，匹配度大于75%的予以確認。數(shù)據(jù)處理：通過GC-MS分析檢測得出生姜梨酒風(fēng)味物質(zhì)的總離子流圖，采用數(shù)據(jù)分析軟件進行譜庫檢索及相關(guān)文獻分析，對相應(yīng)的風(fēng)味物質(zhì)成分進行鑒定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

本試驗利用 Microsoft Office Excel 2010 軟件進行數(shù)據(jù)的基本處理，用 IBM SPSS Statistics 21.0 分析軟件進行方差分析，用 LSD法對數(shù)據(jù)進行差異性分析(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母發(fā)酵對生姜梨酒理化指標(biāo)的影響

2.1.1 不同酵母發(fā)酵對生姜梨酒酒精度的影響

比較5株單一酵母及其兩兩復(fù)配后發(fā)酵的梨酒酒精度，結(jié)果如圖1所示。

5株單一酵母復(fù)配酒精度范圍為7.15%～12.42%vol，其中B和C復(fù)配發(fā)酵酒精度為7.15%vol，明顯低于B、C單菌發(fā)酵的酒度(P<0.05)。原因可能是2個酵母生長發(fā)酵過程中相互制約，影響彼此酵母生長及后期轉(zhuǎn)化酒精速率。相同糖度情況下，酒精轉(zhuǎn)化率越高，則此酵母的產(chǎn)酒能力越強[12]。由圖1可知，B、B與D、E與D或C復(fù)配發(fā)酵不存在顯著性差異(P>0.05)，產(chǎn)酒能力最佳，達12.42%vol，高于其他幾個組合。其中E與D復(fù)合發(fā)酵與其單菌發(fā)酵存在顯著性差異(P<0.05)，說明E與D復(fù)配在產(chǎn)酒精方面為相互促進作用。

2.1.2 不同酵母發(fā)酵對生姜梨酒還原糖的影響

比較5株單一酵母及其兩兩復(fù)配后發(fā)酵的梨酒的還原糖含量，結(jié)果如圖2所示。

5株單一酵母還原糖質(zhì)量濃度范圍為0.58～14.98 g/L，發(fā)酵基本完成。復(fù)配后范圍為1～59.4 g/L，其中A和B復(fù)合發(fā)酵還原糖為48.0 g/L，B和C復(fù)合發(fā)酵還原糖為59.4 g/L，與其他酒樣存在差異性顯著(P<0.05),發(fā)酵不完全，原因可能是：在相同的發(fā)酵時間條件下，A和B、B和C酵母在共發(fā)酵過程中為生長競爭性抑制，可能存在B代謝物質(zhì)影響另一酵母對糖的轉(zhuǎn)化能力，降低糖的利用率，發(fā)酵速率較慢。遂在相同發(fā)酵時間內(nèi)，此2種梨酒還未完成發(fā)酵，發(fā)酵力低于其他酵母。而D、E及D與E復(fù)配的還原糖很低，側(cè)面反映相同時間內(nèi)其酒精轉(zhuǎn)換能力較好。

2.1.3 不同酵母發(fā)酵對生姜梨酒總酸的影響

比較5株單一酵母及其復(fù)配后發(fā)酵的梨酒的總酸含量，結(jié)果見圖3所示。果酒中適當(dāng)?shù)乃岷坑欣谫x予果酒適口性，改善酒體顏色，抑制雜菌，增加酒體穩(wěn)定性[13]?？偹彷^低，則酒體柔和、圓潤；若總酸量過高，則酒體粗糙、瘦弱。此外，總酸也能影響果酒的顏色和穩(wěn)定性。由圖3可知，5株單一酵母及復(fù)配果酒酸度范圍為2.370～3.446 g/L。其中E無論是單一發(fā)酵還是與C復(fù)配，酒樣酸度均最高，達到3.446 g/L左右(P>0.05)。結(jié)合品酒員對生姜梨酒的嘗評結(jié)果，D與E的總酸為3.240 g/L為最適酸度，增加酒的爽口性、協(xié)調(diào)性。本結(jié)果與田學(xué)梅[10]梨酒的最適酸度4.00 g/L有差異，原因可能是梨酒的糖酸比不同影響了酸的適口性，相同酸度情況下，糖度越低，對酸度的敏感性越強。

2.1.4 不同酵母發(fā)酵對生姜梨酒總酯的影響

比較5株單一酵母及其復(fù)配后發(fā)酵的梨酒的總酯含量，結(jié)果見圖4所示。

酯類是果酒香氣物質(zhì)的組成成分，其中酵母菌在發(fā)酵和陳釀過程中賦予果酒濃郁的酒香，是影響果酒香氣特征最關(guān)鍵因素之一[14]?？梢酝ㄟ^測定總酯大概判斷酒類風(fēng)味的豐富程度[15-16]。由圖4可知，除了E+A組合以外，其他5種復(fù)合酵母組合總酯含量有顯著性差異(P<0.05)，但相較于單菌發(fā)酵，總酯含量均有所提高，酵母復(fù)配利于增加果酒風(fēng)味的豐富性。

2.2 不同酵母發(fā)酵對生姜梨酒感官品質(zhì)的影響

理化分析結(jié)果僅視為果酒的感官質(zhì)量提供參考，果酒實際評價應(yīng)針對視覺、嗅覺、味覺方面的刺激所形成的總體印象而判斷。不同酵母發(fā)酵對生姜梨酒品質(zhì)的影響的感官雷達圖見圖5所示。綜合圖5中的外觀、香氣和口感3個指標(biāo)得出：單一酵母中，綜合感官評價得分最高的是E發(fā)酵的生姜梨酒，為84分，其風(fēng)味口感最佳，果香、酒香突出，有淡淡的生姜清香，酒體豐滿，口感醇厚；其次是D為82分，果香、酒香、姜香突出，酸甜適中；B與C酒樣的感官評分相差不大，其中A的得分最低，酒體比較單薄。復(fù)配酵母中，E+D酒樣得分最高為88分，其酒體澄清，色澤淺黃有光澤，口感醇厚，酸甜適中，具有濃郁的梨果香和淡淡的生姜香，典型性比較明確。其品評結(jié)果與理化指標(biāo)測定中體現(xiàn)的菌株的發(fā)酵力、降糖能力、總酸最適含量結(jié)果基本一致。因此，綜合理化分析和感官評價發(fā)現(xiàn)安琪果酒酵母與Pichiaanomala組合更適合生姜梨酒的發(fā)酵。

2.3 不同酵母對生姜梨酒風(fēng)味物質(zhì)的影響

香氣成分是果酒優(yōu)劣的關(guān)鍵因素，本試驗對單一酵母發(fā)酵和復(fù)合酵母發(fā)酵的果酒樣品進行GC-MS分析，根據(jù)色譜的百分比報告和譜庫檢索報告分析，11種酒樣的香味物質(zhì)對比結(jié)果見表2所示。

由表2物質(zhì)成分結(jié)果發(fā)現(xiàn)：11種酒樣中的揮發(fā)性香氣物質(zhì)成分種類大致相似，共測出35種香氣物質(zhì)，分別為醇類10種、酯類12種，萜烯類12種、苯酚類1種。11種酒樣中共有物質(zhì)有7種，分別為苯乙醇、D-香茅醇、辛酸乙酯、乙酸異戊酯、正己酸乙酯、乙酸乙酯、癸酸乙酯等。

2.3.1 醇類物質(zhì)分析比較

醇類物質(zhì)共檢測出10種(不計乙醇)，主要有異戊醇、異丁醇、苯乙醇等。11種酒樣醇類物質(zhì)種類分別為3、6、2、3、6、6、5、3、4、4、7種，占總含量的11.24%、13.26%、2.91%、21.22%、15.94%、16.03%、12.92%、21.25%、13.76%、16.08%、15.00%，其中共有的醇類為異丁醇、苯乙醇。

注：“-”表示未檢出。

醇類主要來自于發(fā)酵過程中酵母代謝產(chǎn)生、其次也來源于糖苷類前體和酯類分解等[17]。在11種酒樣中，不同酵母發(fā)酵結(jié)果顯示，11種梨酒中異戊醇和苯乙醇含量最多，二者的含量占總醇類(除乙醇外)含量的72.0%～96.5%構(gòu)成酒體主要香氣，與周雪艷等[18]研究發(fā)現(xiàn)，梨果酒中檢出香氣成分中，含量最高的成分為異戊醇、苯乙醇一致。異戊醇，具有水果香和花香，是酵母代謝的產(chǎn)物。苯乙醇具有玫瑰的香氣[19]，有一定的殺菌作用，給人以柔和愉悅的感受，顯示了異戊醇和苯乙醇是生姜果酒中的主要風(fēng)味之一。其中B+D酒樣中苯乙醇相對含量最高達10.71%，單菌發(fā)酵D酒樣達6.62%，可能是Pichiaanomala優(yōu)產(chǎn)苯乙醇。異丁醇具有刺激性的氣味，隨著濃度的增高對眼睛皮膚、黏膜和上呼吸道的刺激作用越大，安琪果酒酵母產(chǎn)異丁醇相對含量較高。正己醇等醇類也能賦予酒特殊香氣，且高級醇也是某些酯類物質(zhì)的前體物質(zhì)增加了生姜梨酒后發(fā)酵時期形成的酯類種類，對呈香有重要作用，能夠提高酒的感官品質(zhì)。且D酒樣和B+D酒樣的總醇類物質(zhì)較多，達21.25%,其酵母適合發(fā)酵稍高酒度的果酒。E+D酒樣中醇類香氣物質(zhì)種類最為豐富，達7種，且2個酵母復(fù)配產(chǎn)生了新的香味物質(zhì)Α-畢橙茄醇，增加梨酒香味物質(zhì)成分，為生姜梨酒提供棉厚感。

2.3.2 酯類物質(zhì)分析比較

酯類物質(zhì)共檢測出12種，主要有辛酸乙酯、正己酸乙酯等。11種酒樣酯類物質(zhì)種類分別為7、7、6、7、6、7、6、9、7、6、10種，占7.61%、7.93%、6.05%、8.70%、9.63%、5.90%、6.27%、10.97%、5.68%、2.70%、4.34%。其中共有的酯類有辛酸乙酯、乙酸異戊酯、正己酸乙酯、乙酸乙酯、葵酸乙酯。

揮發(fā)性酯是組成香氣化合物的最重要種類，它們賦予葡萄酒和其他發(fā)酵飲料主要的水果香氣[20]。大多數(shù)酯類具有花、果香氣，在酵母代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)中，酯對酒的風(fēng)味貢獻最大[21]。酯類主要有辛酸乙酯、正己酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸乙酯等。在11種酒樣中，辛酸乙酯相對含量最高，具有白蘭地酒的茴香味，與李麗梅等[22]報道辛酸乙酯是梨的特征芳香成分相一致。同時，具有似葡萄酒香和白蘭地香氣的癸酸乙酯[23]和具有曲香、菠蘿香的正己酸乙酯[24]相對含量也很高，使酒聞起來更濃郁；乙酸己酯有梨和獼猴桃香氣，有似梨的酸甜味，貢獻于生姜梨酒香氣的形成。釀酒過程中酯類香氣的形成與酵母菌的酯酶或醇?；D(zhuǎn)移酶有關(guān)，含量最豐富的是乙酸酯，其次是飽和脂肪酸乙酯[25]，而本試驗中作為飽和脂肪酸乙酯的辛酸乙酯含量最高，可能與釀酒酵母細胞內(nèi)的EHT1 和EEB1 基因編碼醇酰基轉(zhuǎn)移酶過量表達有關(guān)[26-27]。

其中E+D酒樣中的酯類香氣物質(zhì)種類最為豐富，達10種。且2個酵母復(fù)配產(chǎn)生了新的香味物質(zhì)乙酸香葉酯(0.08%)和乙酸苯乙酯(0.32%)，乙酸香葉酯清甜而柔和[28]，似有玫瑰、香檸檬、薰衣草的香氣，增加生姜梨酒香味物質(zhì)成分；乙酸苯乙酯，類似蘋果、桃子的果香及威士忌樣的香韻，適當(dāng)含量可以緩解苯乙醇給梨酒帶來的悶香感。

2.3.3 萜烯類物質(zhì)分析比較

萜烯類物質(zhì)主要表現(xiàn)出果實的品種[29]。在11種酒樣中，萜烯類物質(zhì)共檢測出12種，主要的化合物有D-香茅醇[30](玫瑰香氣)、橙花醇[31](玫瑰香氣)。11種酒樣萜烯類物質(zhì)種類分別為5、4、6、7、3、6、8、2、4、7、9種，占2.33%、2.85%、4.74%、3.70%、1.11%、9.52%、7.22%、2.40%、2.99%、2.85%、2.70%，共僅有D-香茅醇，分別占總香氣成分的1.56%、1.87%、2.92%、2.68%、0.53%、3.86%、2.82%、2.25%、1.05%、0.96%、1.05%，作為葡萄酒中的特有的香氣成分特征，在生姜梨酒中也是一種香氣特征，但因為D-香茅醇香氣含量不一致而形成各自的風(fēng)味特點。

A+B組合酒樣和A+E組合酒樣中2-莰醇(過敏、刺激、可引起頭痛等)含量較高，但單一的Yeast-W2發(fā)酵并沒有2-莰醇產(chǎn)生，可能是釀酒Yeast-W2與產(chǎn)香酵母Yeast-全興5#、安琪果酒酵母共發(fā)酵促進了2-莰醇的生成。11種酒樣中，E+D酒樣中萜烯類香氣物質(zhì)種類最為豐富，達9種，保留了生姜梨酒的典型性。

2.3.4 物質(zhì)分析比較結(jié)果

從物質(zhì)含量來看，與其他10個酒樣相比，D+E酒樣的香味物質(zhì)最多，為28種，香型豐富，苯乙醇(玫瑰香)、辛酸乙酯(茴香)和異戊醇(微甜)構(gòu)成酒體的主要香氣，輔以正己酸乙酯(菠蘿香)，癸酸乙酯(葡萄的水果香氣)。綜合香氣成分分析結(jié)果和味覺分析，D+E酒樣中生姜梨果酒香氣成分復(fù)合，各香氣物質(zhì)共同作用增加香氣復(fù)雜性，達到平衡，賦予優(yōu)雅和諧的香味，且高級醇含量及成分均多于其他酒樣，使果酒更加復(fù)雜、濃郁、醇厚，進一步證明了安琪果酒酵母與Pichiaanomala組合更適合生姜梨酒發(fā)酵。

2.4 驗證試驗結(jié)果

對比單一酵母發(fā)酵實驗和復(fù)合酵母發(fā)酵實驗，發(fā)現(xiàn)安琪果酒酵母與Pichiaanomala的組合對糖的代謝能力和酒精的轉(zhuǎn)化生成能力最強。驗證結(jié)果見圖6和圖7所示。

從圖6和圖7可以看出，酒精生成的趨勢與糖降解的趨勢相符，第7天接近發(fā)酵結(jié)束時的酒精度接近最高值，還原糖含量也基本穩(wěn)定。發(fā)酵的前3 d，總酸含量一直呈上升趨勢，但隨著發(fā)酵繼續(xù)生成的有機酸被降解，總酸含量逐步降低，第4～6天總酸含量下降緩慢(P>0.05)。原因可能為發(fā)酵前期，酵母代謝產(chǎn)生有機酸，總酸含量增加，發(fā)酵后期，酵母菌的酒精發(fā)酵將有機酸降解為酒精等小分子物質(zhì)，與張文文等[32]中不同菌種及其混合發(fā)酵方式下發(fā)酵液的總酸呈現(xiàn)相同的變化趨勢，在第2～3天上升至最高，然后緩慢下降。由圖6還可以看出，總酯的含量起伏都在前期有些波動，但在后面趨于穩(wěn)定。

最終發(fā)酵得到的生姜梨酒酒精度為12.47%vol，還原糖3.14 g/L，總酸含量3.133 g/L，總酯含量0.442 g/L，結(jié)合感官分析結(jié)果，得到的酒體清澈透明、有光澤，呈米黃色或淺黃色，口感醇厚，純正柔和、綿軟爽口、爽怡醇厚，具有濃郁的梨果香及淡淡的生姜獨特香氣，且典型性比較明確。因此，安琪果酒酵母與Pichiaanomala組合能釀造出風(fēng)味和品質(zhì)更佳的生姜梨酒。

3 結(jié)論

本研究通過對5株釀酒酵母單菌發(fā)酵與復(fù)合發(fā)酵研制的生姜梨酒進行酒精度、還原糖、總酸、總酯等理化指標(biāo)檢測和感官評定，同時采用GC-MS分析比較其風(fēng)味成分，最終確定安琪果酒酵母與Pichiaanomala為釀制生姜梨酒的最優(yōu)酵母組合，研制所得生姜梨酒酒精度為12.47%vol，還原糖3.14 g/L，總酸含量3.133 g/L，總酯含量0.442 g/L，GC-MS檢測不同釀酒酵母發(fā)酵的生姜梨酒中含有35種香味物質(zhì)，主體香氣成分有辛酸乙酯、正己酸乙酯、癸酸乙酯、異戊醇、苯乙醇等，各種香氣成分之間的相互協(xié)調(diào)，賦予了生姜梨酒的獨特風(fēng)味，得到的酒體澄清，色澤淺黃有光澤，果香純正，口感甜美醇厚，具有濃郁的梨果香和淡淡的生姜香，典型性比較明確。

本文通過不同酵母菌對生姜梨酒發(fā)酵和風(fēng)味的影響研究，確定釀制生姜梨酒的最優(yōu)組合為Pichiaanomala和安琪果酒酵母，豐富果酒種類，結(jié)合研發(fā)需求，為新生代果酒-生姜梨酒的開發(fā)提供理論依據(jù)，以期今后對生姜梨酒的關(guān)鍵技術(shù)和瓶頸技術(shù)研究攻關(guān)，穩(wěn)步提升新生代果酒發(fā)展質(zhì)量，進一步增強果酒市場的核心競爭力。