隨著分子生物學和生物信息學技術(shù)的不斷發(fā)展，病理學從組織學診斷逐漸發(fā)展到從細胞、細胞器到基因和蛋白分子水平檢測，使病理學、分子生物學和病理生理學等多個學科間相互滲透，從DNA和RNA 層面研究疾病的發(fā)生和發(fā)展規(guī)律，揭示疾病的內(nèi)源性基因突變、表達異常以及外源性基因的存在，更深入、精確和全面地反映疾病的本質(zhì)特征，使傳統(tǒng)病理學從單純的形態(tài)學診斷跨入綜合性更強、更全面、更精準的分子病理學。傳統(tǒng)的病理診斷技術(shù)不能用于結(jié)直腸癌早期診斷、指導化療和靶向藥物選擇、療效評估、復發(fā)轉(zhuǎn)移監(jiān)測，而分子病理學的應(yīng)用增加了對結(jié)直腸癌本質(zhì)的深入認識，使病理學從單純形態(tài)學診斷延伸到精準的分子診斷與鑒別診斷、個體化治療方案的制定及預后判斷等方面。

1 分子病理學主要應(yīng)用技術(shù)與結(jié)直腸癌分子分型

利用分子病理學技術(shù)包括顯色原位雜交（CISH）、熒光原位雜交（FISH）、基因芯片（DNA 芯片或DNA 微陣列）及熒光定量PCR 技術(shù)等使病理診斷不再局限于單純形態(tài)學檢查，能夠從基因和分子水平用于結(jié)直腸癌的臨床診斷、個體化精準治療和預后判斷。液體活組織檢查技術(shù)是基于血液、尿液、胸腹腔積液等體液樣本，從循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTC）、循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、血漿miRNA 等方面檢測腫瘤特異性標志物，具有無創(chuàng)、實時動態(tài)監(jiān)測等優(yōu)點，能真實反映腫瘤中基因突變頻譜，用于指導臨床方案制定、療效評估及臨床隨訪[1]。ctDNA 是由腫瘤細胞通過凋亡和壞死過程，直接釋放進入外周血的DNA，檢測少量樣本中ctDNA的突變，可以幫助識別結(jié)直腸癌等腫瘤高危復發(fā)患者，通過動態(tài)觀察治療過程中ctDNA 的變化，幫助發(fā)現(xiàn)新的耐藥機制，選擇有效靶向藥物，實時檢測抗腫瘤療效。ctDNA 表型與標準腫瘤活組織病理學檢查比較，ctDNA 靈敏度為92%，特異度為98%，K-ras 和BRAF 基因突變的判讀準確率為96%，為結(jié)直腸癌等腫瘤患者監(jiān)測化療反應(yīng)和制定個體化治療方案提供可靠依據(jù)[2]。錯配修復基因（mismatch repair，MMR）能夠校正基因復制時出錯的堿基，保持DNA 復制的準確性，避免基因發(fā)生突變，MMR 基因功能缺陷導致微衛(wèi)星體長度發(fā)生變化，發(fā)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定（microsatellite instabe，MSI），參與結(jié)直腸癌發(fā)生[3]。根據(jù)MSI、K-ras、BRAF 的狀態(tài)和MLH1 甲基化狀態(tài)將結(jié)直腸癌分為5 種類型[4]：①pMMR，KRAS 和BRAF 野生型；②pMMR、K-ras 突變型，BRAF 野生型；③pMMR，BRAF 突變型，K-ras 野生型；④散發(fā)型：dMMR、BRAF 突變型，MLH1 超甲基化；⑤遺傳型：dMMR、BRAF 野生型，無MLHI 超甲基化。結(jié)直腸癌的分子分型不僅闡明不同分子亞型結(jié)直腸癌的臨床和病理特征，而且對結(jié)直腸癌的分子異質(zhì)性、個體化治療、療效和預后判定提供客觀的理論依據(jù)。

2 分子病理學在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展與個體化治療中的應(yīng)用

K-ras 基因是癌基因，在結(jié)直腸癌中主要發(fā)生第2 號外顯子的12 和13 密碼子突變，導致p21-ras蛋白的生長信號發(fā)生異常變化，過度的生長信號刺激細胞生長和增殖從而導致結(jié)直腸癌發(fā)生[5]。國外學者報道K-ras 基因突變率為30%～40%，突變見于第2 號外顯子的第12、13 密碼子（85%～95%），第3 號外顯子59/6、117 和146 密碼子（5%～15%）[6，7]。國內(nèi)學者報道K-ras 基因總突變率為38.82%，K-ras基因第12 密碼子突變率為29.7%，第13 密碼子突變率為12.87%；N-ras 基因突變率為3.96%，第12 密碼子突變率為0.99%，第13 密碼子突變率為0.99%[8]。K-ras 基因突變與結(jié)直腸癌患者年齡、腫瘤位置、浸潤深度、組織學類型及Dukes 分期無相關(guān)性，但女性或由淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌患者K-ras基因突變多見，結(jié)腸癌發(fā)生K-ras 基因突變多于直腸癌[9]。結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移K-ras 基因突變率為42.5%，同時性肝轉(zhuǎn)移K-ras 基因突變率為38%，異時性肝轉(zhuǎn)移K-ras 基因突變率為47%，無復發(fā)轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌K-ras 基因突變率為35%，K-ras G13D突變是結(jié)直腸癌異時性肝轉(zhuǎn)移的獨立危險因素[10]。K-ras 基因突變使結(jié)腸癌患者對放療的敏感性下降，而通過抑制結(jié)腸癌細胞K-ras 基因突變表達可提高放療的敏感性[11]。在Ⅲ期結(jié)腸癌患者中，K-ras基因為野生型患者可以從5-Fu 聯(lián)合左旋咪唑化療中獲益，而K-ras 基因突變者則不能獲益，K-ras 基因第12、13 密碼子為非天冬氨酸突變患者，較天冬氨酸突變患者可以從5-Fu 為基礎(chǔ)的化療中獲得更長生存時間[12]。K-ras 基因突變后通過影響細胞的生物學行為刺激促進惡性腫瘤細胞的生長擴散，且不受上游EGFR 的信號調(diào)控影響，對抗EGFR 治療效果差，K-ras 基因突變型結(jié)直腸癌患者不能從抗EGFR 治療中獲益，K-ras 基因突變是抗EGFR 單抗療效不佳的獨立危險因素，以及靶向治療的療效預測指標[13]。 BRAF 是RAS-RAF-MEK-ERK 信號通路中RAS 蛋白的下游信號因子，是部分結(jié)直腸癌重要的原癌基因。國外研究資料表明結(jié)直腸癌腫瘤組織中BRAF 基因突變率為8.97%，均為V600E點突變[14]，而國內(nèi)研究數(shù)據(jù)表明結(jié)直腸癌腫瘤組織中BRAF 基因總突變率為4.14%，其中V600E占3.93%，V600G 占0.01%，D594N 占0.01%[15]。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌BRAF 基因突變檢出率比無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)直腸癌高5～10 倍[16]。BRAF 基因突變的結(jié)直腸癌患者對EGFR 單抗治療抵抗，BRAF 基因突變是判斷針對EGFR 分子靶向藥物cetuximab 或panitumumab 療效的獨立預測因素，亦是結(jié)直腸癌預后不良因素[17]。K-ras 突變結(jié)直腸癌患者不能從西妥昔單抗治療中獲益，PIK3CA 第20 外顯子、N-ras、BRAF 突變與西妥昔單抗治療反應(yīng)率低相關(guān)，對K-ras 野生型的患者，增加PIK3CA第20 外顯子、N-ras、BRAF 檢測，可將抗EGFR 治療獲益人群比例從36.3%提高至41.2%[18]。3.2%～4.5%的K-ras 野生型轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者發(fā)生PIK3CA 第20 外顯子突變，是抗EGFR 靶向治療的潛在不良預后標志[19]。Le 等[20]研究發(fā)現(xiàn)突變結(jié)直腸癌中K-ras 和BRAF 突變是互相排斥的，而且與左半結(jié)腸癌相比，右半結(jié)腸癌BRAF 基因突變率高，右半結(jié)腸癌免疫環(huán)境活躍，表現(xiàn)為MSI-H 比例高，PD-L1 和PD-1 的表達比例高。與MSS 大腸癌患者相比，MSI 型患者抗PD-1 治療效果更好，MSI 型患者反應(yīng)率為40%，20 周無進展生存期（progression-free survival，PFS）為78%；MSS 型患者反應(yīng)率為0，20 周PFS 為11%；MSI 其它型患者反應(yīng)率為71%，20 周PFS 為67%。MSI 狀態(tài)與Ⅲ期結(jié)直腸癌區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，＞7 個區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者更多呈MSI-H 狀態(tài)，而與結(jié)直腸癌患者腫瘤部位、分化程度、浸潤深度、c-MET 表達和CEA 水平無關(guān)[21]。15%結(jié)腸癌發(fā)生MSI-H，尤其右半結(jié)腸癌多見，可引起結(jié)直腸癌對5-Fu 化療不敏感，但預后好于MSS[22]。在以5-Fu 為基礎(chǔ)的化療方案對pMMR 和Ⅲ期dMMR 結(jié)直腸癌患者有效，可提高其無病生存期（disease-free survival，DFS），但對于dMMR Ⅱ期結(jié)直腸癌患者則無此療效，甚至對MSI 結(jié)直腸癌患者有危害，顯著降低其DFS 和總生存期（overall survival，OS）[23]。

3 分子病理學在結(jié)直腸癌預后判斷中的應(yīng)用

轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者治療前后動態(tài)監(jiān)測CTC 數(shù)目變化與患者預后相關(guān)，CTC 數(shù)目≥3 個/7.5ml 患者的腫瘤PFS 和OS 均顯著短于CTC 數(shù)目＜3 個/7.5ml的低檢出患者[24]。治療期間CTC 數(shù)目是結(jié)直腸癌患者PFS 和OS 的獨立因素，進展期和轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者外周血中基線或治療期間CTC 數(shù)目升高是腫瘤無復發(fā)生存（relapse-free survival，RFS）、PFS和OS 不良的獨立因素[25]。外周血ctDNA 檢測能實時反映腫瘤負荷水平及基因突變的動態(tài)變化，ctDNA 水平與結(jié)直腸癌預后呈負相關(guān)，在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中更為明顯，突變型ctDNA 明顯升高的患者預后更差[26]。BRAF 在結(jié)直腸癌中的突變率為5%～15%，在MSI-H 腫瘤中突變率明顯高于MSS腫瘤，BRAF 突變多發(fā)生在第15 外顯子V600E，BRAF 突變提示結(jié)直腸癌預后不良[27]。發(fā)生MSI結(jié)直腸癌患者化療總有效率為11.4%，疾病控制率（disease control rate，DCR）為51.4%；MSS 組總有效率為7.7%，DCR 為41%，MSI 結(jié)直腸癌患者中位PFS 為19.9 個月，而MSS 患者中位PFS 僅7 個月。MSI 結(jié)直腸癌患者PFS 和OS 顯著優(yōu)于MSS患者，MSI 患者比MSS 患者有更好的PFS 和DCR，MSI-H 分型結(jié)直腸癌患者OS 和DFS 均優(yōu)于MSS/MSI-L 分型患者，MSI 可作為PFS 的獨立預測指標[28]。MSI 結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯低于MSS 結(jié)直腸癌患者，MSS 結(jié)直腸癌患者術(shù)后1、3、5年生存率為96.3%、72.2%、63.5%；MSI 患者術(shù)后1、3、5年生存率為100.0%、92.3%、92.3%。MSS 與MSI 患者術(shù)后1年生存率無明顯差異，但MSI 患者3年生存率、5年生存率明顯高于MSS 患者，具有生存優(yōu)勢[29]。K-ras 野生型轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者，無論使用何種靶向治療方法，原發(fā)于左半結(jié)腸癌患者OS 和PFS 均明顯優(yōu)于原發(fā)于右半結(jié)腸癌患者[30]。K-ras 基因野生型結(jié)直腸癌患者中一線分子靶向藥物cetuximab 或panitumumab 單抗聯(lián)合化療對攜有BRAF 基因突變型患者預后生存明顯短于BRAF 基因野生型患者[31]。攜帶PIK3CA 突變的結(jié)直腸癌患者，長期服用阿司匹林可獲得較長的生存期，而對野生型的PIK3CA 患者則無效，因為激活的PI3K 促進了環(huán)氧化酶2 的活性和前列腺素E 的合成，抑制結(jié)直腸癌細胞的凋亡，而阿司匹林對此有拮抗作用[32]。結(jié)直腸癌dMMR 缺失率為22.22%，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高于pMMR 患者，dMMR 患者術(shù)后5年生存率為88.89%，pMMR 患者5年生存率為59.52%，二者5年生存率差異顯著[33]。攜帶BRAF 基因突變同時存在MSI-H 結(jié)直腸癌患者5年生存率為73%，而非MSI-H 的BRAF 突變患者5年生存率為46%，晚期直腸癌患者BRAF 基因突變提示預后較差，總體生存率僅為9～14 個月[34]。Ⅲ期結(jié)直腸癌Ras/BRAF 基因突變患者，尤其存在BRAF 突變的患者OS 和PFS 明顯低于Ras/BRAF 基因野生型者，而N-ras 突變的患者預后較其他基因突變者好，Ras/BRAF 基因突變和MSI-L/MSS 狀態(tài)是結(jié)直腸癌預后不良的預測因子[20]。具有BRAF 和K-ras 基因雙重野生型的結(jié)腸癌患者，5年生存率為93%，而具有BRAF 或K-ras 突變的患者5年生存率為76%，BRAF 或K-ras 基因突變具有顯著的預后意義，可作為MSI 結(jié)直腸癌患者的預后因子[35]。結(jié)直腸癌患者腫瘤組織和/或外周血RAS、BRAF 和MMR 等基因表達和功能狀態(tài)的檢測，在結(jié)直腸癌患者治療預后評估中發(fā)揮了重要指導作用。

將MMR、MSI、K-ras、N-ras、BRAF 等分子檢測用于結(jié)直腸癌診斷、個體化治療和預后評估，使結(jié)直腸癌診療模式從傳統(tǒng)的基于“群體化”診治轉(zhuǎn)向精準的“個體化”診療。分子病理學不僅用于結(jié)直腸癌早期診斷和精準的分子分型，而且能夠為結(jié)直腸癌個體化、預見性治療以及預后判斷與監(jiān)測提供科學依據(jù)，拓寬了病理學研究范圍，能夠從分子水平認識結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展、形態(tài)特征、生物學行為。雖然分子病理診斷技術(shù)日趨成熟，但目前主要用于研究領(lǐng)域，真正用于臨床結(jié)直腸癌等腫瘤檢測的技術(shù)仍然較少，而且檢測費用昂貴、操作復雜、影響因素較多，存在技術(shù)性假陽性和假陰性，仍不能完全取代目前的常規(guī)病理診斷方法，腫瘤病理診斷仍必須堅持以形態(tài)學為基礎(chǔ)，分子診斷為輔的原則。