柑橘潰瘍病菌胞外蛋白水解酶對其致病力的作用

徐鑫焱, 李艷嬌, 戶 勛, 鄒華松

(福建農林大學植物保護學院閩臺作物有害生物生態(tài)防控國家重點實驗室，福建 福州 350002)

胞外水解酶是植物病原細菌的重要致病因子，其通過病原細菌的Ⅱ型分泌系統(tǒng)泌出胞外后，對寄主組織進行降解，促進病害的發(fā)生[1-3].胞外蛋白水解酶是植物病原細菌胞外水解酶的一種，能夠降解寄主植物細胞壁，協(xié)助病原菌完成寄生，因此，蛋白水解酶活性對細菌菌株的致病力有重要作用[4-7].甘藍黑腐病菌(Xanthomonascampestrispv.campestris)的蛋白酶缺失突變體在蕪菁葉片上的致病力下降，病情指數僅為野生型的1/4[6].水稻條斑病菌(X.oryzaepv.oryzicola)RS105菌株具有較強的胞外蛋白水解酶活性，基因組中含有2個胞外蛋白水解酶基因ecpA和ecpB,ecpA突變后蛋白水解酶活性完全喪失，致病力減弱[8].

柑橘黃單胞柑橘亞種(X.citrisubsp.citri,Xcc)是引起柑橘潰瘍病的亞洲種，其致病力最強，分布也最為廣泛[9].在Xcc306菌株中，將Ⅱ型分泌系統(tǒng)的xpsD基因突變，胞外纖維素酶、蛋白水解酶和淀粉酶活性均降低[10-11].以中國菌株Xcc29-1為出發(fā)菌，得到的xpsD突變體胞外纖維素酶、蛋白水解酶和淀粉酶活性也降低[12].在對Xcc29-1菌株纖維素酶基因進行研究的過程中，發(fā)現BglC3和EngXCA都具有降解硝酸纖維素的能力，但是僅BglC3能被Xcc29-1分泌到細胞外;將BglC3編碼基因突變后，Xcc29-1胞外纖維素酶的活性完全喪失，在柑橘上的致病力減弱[13].有關Xcc菌株蛋白水解酶功能的研究很少.研究顯示，Xcc306菌株的胞外蛋白酶基因XAC0929突變后，細胞運動能力及生物膜形成能力都下降，但是其對致病力的影響還不清楚[14].

本研究根據柑橘潰瘍病菌Xcc29-1的基因組信息，鑒定其含有的胞外蛋白水解酶基因，并構建胞外蛋白水解酶缺失菌株，研究胞外蛋白水解酶對致病力的影響，旨在為揭示Xcc的致病機理提供依據.

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

本研究所用的菌株和質粒見表1.大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)在LB培養(yǎng)基中于37 ℃下培養(yǎng).Xcc野生型菌株29-1及突變體在牛肉浸膏培養(yǎng)液NB或固體培養(yǎng)基NA(含有1.5%瓊脂粉)中于28 ℃下培養(yǎng)[15].本研究所用的抗生素為卡那霉素(kanamycin, Km)20 μg·mL-1、壯觀霉素(spectinomycin, Sp)20 μg·mL-1.

表1 本研究所用的菌株和質粒Table 1 Bacterial strains and plasmids used in this study

1.2 Xcc 29-1胞外蛋白水解酶基因鑒定

將Xcc29-1基因組中(GenBank登錄號PRJNA193774)注釋為蛋白水解酶的6個基因，克隆到原核表達載體pET41a(+)，克隆所用的特異性引物見表2.PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性35 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min.將6個構建的載體轉化到大腸桿菌BL21(DE3)后，在含有5%脫脂奶粉的LB平板上檢測胞外蛋白酶活性，制備平板前加入終濃度為1.0 mmol·L-1的IPTG.參照Zou et al[8]的方法，將培養(yǎng)的大腸桿菌制備成D600 nm=0.5的菌懸液，吸取2 μL滴加到平板表面，在超凈工作臺上吹干后置于37 ℃培養(yǎng)2 d.菌落周圍的水解圈大小即可反映胞外蛋白水解酶活性.測量每個水解圈直徑，并與pET41a(+)空載體進行比較.

表2 用于分子克隆的引物1)Table 2 Primers used for molecular cloning

1)下劃線表示引物5′端的酶切位點.

1.3 Xcc 29-1胞外蛋白水解酶缺失突變體構建

在自殺載體pKMS1中構建了3個重組質粒pKMS-P1、pKMS-P3和pKMS-P6，分別用于對ecpA、ecpF和ecpG以及ecpC、ecpD、ecpE進行分步缺失.根據Xcc29-1的基因組信息設計特異性引物(表2)，先擴增突變基因的上游和下游片段，通過重疊PCR融合2個片段后，再克隆到自殺載體pKMS1(表1).將pKMS-P1電轉進入野生型Xcc29-1菌株，在含Km的NA平板(不含蔗糖的NA)上篩選發(fā)生第1次同源交換的重組子；在含10%蔗糖的NA平板上篩選發(fā)生第2次同源交換的重組子；將重組子在含蔗糖的NA和含有Km的NA平板上培養(yǎng).在含蔗糖的NA平板上生長正常但在含有Km的NA平板上不生長的即為發(fā)生了2次同源交換的缺失突變體.用擴增上游片段的正向引物ecpA.1.F和擴增下游片段的反向引物ecpA.2.R進行菌落PCR，確定目標基因ecpA被從Xcc29-1中敲除，得到的突變體命名為ΔP1.按照同樣的操作步驟，將pKMS-P2電轉進入ΔP1，對ecpF和ecpG2個基因進行缺失突變，得到缺失3個編碼基因的突變體ΔP3；將pKMS-P3電轉進入ΔP3，對ecpC、ecpD、ecpE3個基因進行缺失突變，得到胞外蛋白水解酶活性完全喪失的ΔP6.

1.4 胞外蛋白水解酶過表達菌株構建

設計特異性引物(表2)擴增ecpA和ecpE的編碼序列，克隆到載體pBB-PXAC1347的XhoⅠ-HindⅢ位點.pBB-PXAC1347是在粘粒載體pBBR1MCS-5的KpnⅠ-XhoⅠ位點克隆了553 bpXAC347基因的啟動子[17]，得到的重組載體pBecpA和pBecpE分別電轉進入野生型Xcc29-1.

1.5 生物膜測定

在NB液體培養(yǎng)基中將Xcc蛋白酶缺失突變菌株ΔP6培養(yǎng)至D600 nm=1.5左右，用新鮮的NB液體培養(yǎng)基將培養(yǎng)液調整為D600 nm=0.5的菌懸液.取3 mL菌懸液加入25 mL玻璃試管中，在28 ℃靜置培養(yǎng)3 d.緩緩倒掉NB培養(yǎng)液，取4 mL無菌水沿著試管壁輕輕加入管底，緩慢旋轉試管漂洗浮游的Xcc細胞.取4 mL結晶紫染液染色15 min后，用4 mL無菌水輕輕漂洗2次，去除多余的結晶紫染液，并觀察附著在試管壁上的Xcc細胞.漂洗過后的試管置于室溫風干，加入500 μL無水乙醇，輕輕搖晃將試管內的結晶紫洗脫干凈，測定所得溶液的D595 nm，以此確定生物膜的形成能力[18].

1.6 致病力和生長速度測定

將Xcc29-1菌株在NB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至D600 nm=1.5左右，離心收集菌體，用無菌水重新懸浮菌體，制備成D600 nm=0.3的菌懸液(108CFU·mL-1)，按10倍比例稀釋得到107和106CFU·mL-1的菌懸液.針刺創(chuàng)傷接種：用針頭在柑橘葉片上刺5個傷口，呈“梅花狀”，滴加50 μL菌懸液后，迅速用一片保鮮膜覆蓋接種部位以保濕，1 d后揭走保鮮膜.注射接種：用無針頭注射器將制備的菌懸液打入柑橘葉片.注射和針刺接種后持續(xù)觀察病害的發(fā)生情況，并分別在第5天和第10天拍照記錄.

按照注射接種方法將D600 nm=0.3的菌懸液接種至柑橘葉片.注射完成后，即刻用圓形打孔器在注射區(qū)域打下2 cm2葉片，放入已滅菌的1.5 mL離心管中.經無菌水漂洗兩遍后，加入500 μL無菌水，搗碎葉片.采用10倍梯度稀釋方法，將菌懸液稀釋至合適濃度，取100 μL每個稀釋濃度的菌懸液涂布NA平板，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng).待長出單菌落后，計數平板上的菌落數量；此后，分別第2、4和6天取樣，計數菌落數量.葉片中細菌數量按照每平方厘米所含有的細菌總量計算，并以其log10的值作圖.

1.7 熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)

表3 用于定量PCR分析的引物Table 3 Primers used for qRT-PCR analyses

試驗所用引物見表3.將Xcc29-1菌株在NB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至D600 nm=1.5左右時，離心收集菌體，用Trizol(Ambion，15596-026)提取總RNA.制備D600 nm=0.3的菌懸液并注射接種至柑橘葉片，3 d后采集注射葉片，經液氮速凍磨碎后用Trizol(Ambion，15596-026)提取總RNA.在分光光度計上測定D260 nm/D280 nm值，檢測總RNA樣品的質量.DNaseⅠ消化總RNA中殘留的基因組DNA后，用AMV反轉錄酶(TaKaRa)進行反轉錄，在CFX Connect real-time system(Biorad)上用iTaq Universal SYBR Green Supermix(Bio-rad)進行定量分析，gyrA基因當作內參基因.反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，58 ℃延伸30 s，40個循環(huán).相對表達量統(tǒng)計分析在軟件CFX Maestro(Biorad)中完成.

2 結果與分析

2.1 Xcc 29-1胞外蛋白酶編碼基因的鑒定

Xcc29-1的基因組序列含有1個染色體和3個質粒，注釋為蛋白酶的6個基因全部位于染色體上.XAC29_04720、XAC29_04725和XAC29_04730在染色體上緊密相鄰，位于染色體1 093 947～1 099 382 bp的位置；XAC29_14090的編碼序列大小為1 098 bp，編碼產物是水稻條斑病菌胞外蛋白酶EcpA的同源物，在染色體上位于3 250 939～3 252 036 bp的位置，附近沒有注釋為蛋白酶的基因；XAC29_14430和XAC29_14440基因位于染色體3 335 232～3 339 574 bp的位置(圖1A).在Xcc29-1中沒有發(fā)現ecpB的同源基因.除了已經明確XAC29_14090為ecpA基因外，按照染色體上的排列順序，將XAC29_04720、XAC29_04725、XAC29_04730、XAC29_14430和XAC29_14440分別命名為ecpC、ecpD、ecpE、ecpF和ecpG(圖1A).胞外蛋白水解酶通過Ⅱ型分泌系統(tǒng)分泌到細胞外，因為BL21(DE3)菌株含有一個完整的Ⅱ型分泌系統(tǒng)，所以可以作為鑒定胞外水解酶的宿主.本研究利用原核表達系統(tǒng)在BL21(DE3)菌株中對Xcc29-1的6個蛋白水解酶的活性進行鑒定.在含有5%脫脂奶粉的LB固體平板上， 6個重組載體所產生的水解圈直徑均比pET41a(+)空載體增加了1倍左右，表明這6個基因具有胞外蛋白水解酶活性(圖1B、1C).

2.2 Xcc 29-1胞外蛋白酶缺失突變體的構建

利用自殺載體分3次將6個編碼基因全部從野生型菌株中敲除：第1次敲除1 098 bp的ecpA基因，第2次敲除ecpF和ecpG基因，第3次敲除ecpC、ecpD和ecpE基因.在連續(xù)敲除過程中，第1次和第2次敲除都能夠讓胞外蛋白水解酶活性稍微減弱(圖2A)，這表明Xcc29-1含有多個胞外蛋白水解酶基因.最后，用3對引物(ecpA.1.F/ecpA.2.R、ecpF.1.F/ecpG.2.R和ecpC.1.F/ecpE.2.R)對胞外蛋白水解酶基因缺失突變體ΔP6進行菌落PCR擴增，所得到的產物大小分別為1 116、983和1 273 bp，回收PCR產物測序，確定ΔP6的基因組中缺失ecpA、ecpC、ecpD、ecpE、ecpF和ecpG共6個基因(圖2B).

2.3 蛋白酶缺失突變體ΔP6的致病力

在針刺創(chuàng)傷接種5 d后，濃度為108CFU·mL-1的ΔP6菌懸液誘導傷口部位出現潰瘍病斑，病斑出現的時間與野生型沒有區(qū)別，但潰瘍病斑發(fā)展速度較野生型慢；接種濃度為107和106CFU·mL-1的ΔP6菌懸液時，潰瘍病斑出現的時間均比野生型晚1 d；接種10 d后3個接種濃度的傷口部位都出現木栓化隆起，但隆起程度都比接種相應濃度的野生型菌株低(圖3).在注射接種試驗中，接種部位出現潰瘍病斑的時間比針刺創(chuàng)傷接種早2 d，在第3 天即可觀察到水漬狀癥狀，接種5 d后可以清晰地看到潰瘍癥狀(圖3).在相同的接種濃度下，突變菌株ΔP6形成的潰瘍癥狀比野生型菌株弱，表明突變菌株ΔP6的致病力變弱.

2.4 蛋白酶缺失突變體ΔP6形成生物膜的能力

將培養(yǎng)好的ΔP6菌液在玻璃試管中靜置培養(yǎng)3 d后，在氣液交界面能夠觀察到附著在試管壁上的細胞，但附著能力比野生型弱.清洗沒有附著的游離細胞后，經結晶紫染色能清晰看出ΔP6形成的生物膜較少(圖4A).定量測定顯示，ΔP6附著在管壁的生物膜比野生型低30%(圖4B).因此，胞外蛋白酶缺失降低了Xcc29-1形成生物膜的能力.

2.5 過表達蛋白酶形成的水漬狀潰瘍斑

過表達ecpA和ecpE基因的Xcc29-1的胞外蛋白水解酶活性都增強(圖5A、5B).采用高濃度108CFU·mL-1菌懸液注射接種離體柑橘葉片后，潰瘍癥狀出現的時間未比野生型提前，同在第3天出現水漬狀病斑；但在癥狀發(fā)展過程中，過表達菌株形成的潰瘍斑水漬狀比野生型明顯.接種5 d后，野生型菌株誘導的潰瘍斑會隆起硬化，呈深綠色，而過表達菌株誘導的病斑呈淺綠色(圖5C)，這可能是由于蛋白酶對寄主細胞壁的降解作用加劇了植物組織的解離.此外，過表達菌株在柑橘葉片中的繁殖速度加快，而突變體ΔP6在柑橘葉片中的繁殖速度變慢(圖5D).

2.6 胞外蛋白水解酶基因在柑橘葉片上的表達

利用qRT-PCR檢測了6個編碼基因在豐富培養(yǎng)基NB和柑橘葉片中的表達情況.與NB培養(yǎng)條件相比，6個基因的轉錄水平均在柑橘葉片中增強，其中，ecpA的表達水平增強了6倍多，ecpE基因的增強幅度最大，接近80倍(圖6).

3 討論

在自然發(fā)病時，潰瘍病的典型癥狀是形成木栓化突起，伴隨有細胞死亡[9]；人工注射接種柑橘潰瘍病菌后最先出現的可觀察癥狀是水漬狀，隨著接種部位的細胞膨大和細胞分裂，細胞間隙逐漸喪失，使得細胞壁緊密靠攏，最后形成隆起[13].已有研究表明，植物病原細菌產生的蛋白酶具有組織浸離作用，從Erwiniacarotovora中純化的蛋白酶還能誘導黃瓜細胞的死亡[19-20].本研究中，采用針刺創(chuàng)傷接種時，Xcc蛋白酶缺失突變體ΔP6在傷口位置形成的木栓化隆起變弱；在注射接種中，形成的水漬狀程度也減弱；而過表達菌株的接種會使得注射區(qū)域的水漬狀表型更明顯.因此，Xcc的蛋白酶對潰瘍癥狀的形成有重要作用.

生物膜是細菌產生的一種包圍菌體的復雜結構，含有胞外多糖、纖維蛋白、脂蛋白和DNA等多種成分[21].生物膜的形成，使得細菌獲得一個天然屏障，阻礙來自寄主植物的抗菌物質，抵抗紫外照射、pH和滲透壓變化等多種逆境，也有利于病原細菌在寄主表面的附著，幫助其成功侵染植物[22].Xcc的生物膜在侵染早期可以幫助細菌在寄主表面存活，有利于細菌的侵染和定殖，從而增強其在柑橘寄主上的致病力[23].在基因組學水平上從Xcc306菌株中鑒定出至少92個基因參與生物膜的形成，包括蛋白酶ecpD(XAC0929)基因[14].本研究將Xcc29-1的胞外蛋白酶基因全部敲除以后，突變體形成生物膜的能力明顯下降，這與Ⅱ型分泌系統(tǒng)xpsD和xcsD基因突變導致生物膜形成能力下降的結果[24]一致.但Xcc合成的蛋白酶為什么不會對形成生物膜的蛋白組分進行降解，反而會促進生物膜的形成，值得進一步探討.

雖然胞外蛋白水解酶是植物病原細菌的一個重要致病因子，但是不同種甚至不同生理小種之間胞外蛋白水解酶活性存在差異.一方面，不同病原物所含有的水解酶編碼基因數量不同.例如：水稻細菌性條斑病菌S105中只含有1個具有胞外蛋白水解酶活性的基因ecpA[8]；而本研究中的柑橘潰瘍病菌Xcc29-1菌株則含有6個編碼基因.另一方面，不同病原物中同源基因的序列存在多樣性.如水稻白葉枯病菌(X.oryzaepv.oryzae)PXO99A中的ecpA基因在第846個堿基位置多出5個核苷酸，造成移碼閱讀，使得PXO99A沒有胞外蛋白水解酶活性[8].

從Xcc29-1的Ⅱ型分泌系統(tǒng)突變后的致病表型推測，單個蛋白水解酶對致病力的影響有限[25].因此，本研究沒有詳細分析單個蛋白酶缺失對致病力的影響.實驗室先前對胞外纖維素酶的研究發(fā)現，Xcc29-1對纖維素酶的泌出具有特異性[13]；而Xcc29-1對蛋白酶的泌出是否具有特異性尚需進一步驗證.