張作丹呂輝照趙楓李傳玲曾燕坤

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)樘卣鞯穆躁P(guān)節(jié)疾病，是中老年人常見的一種關(guān)節(jié)疾病。在該病理過程中，包括腫瘤壞死因子-（tumornecrosisfactor-，TNF-）在內(nèi)的多種細(xì)胞因子參與調(diào)節(jié)OA的炎性反應(yīng)，而TNF-也能反映膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的轉(zhuǎn)歸[1]。近年來，臭氧已逐步應(yīng)用于膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的治療，但其確切機(jī)制尚未完全明了。本研究旨在觀察膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)臭氧治療對關(guān)節(jié)液中TNF-水平的影響，探討該療法的TNF-機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

自2012年2月至2016年2月，在本院納入確診膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的患者77例，其中男30例，女47例；年齡50～81歲，平均（62.20±6.60）歲；病程17～70個(gè)月，平均（46.20±18.10）個(gè)月。所有患者均為單側(cè)膝關(guān)節(jié)，其中左側(cè)57例，右側(cè)20例；VAS評分5～9分，平均（7.67±1.11）分；LKSS評分30～60分，平均（38.67±5.77）分。所有患者根據(jù)就診日期采用SPSS隨機(jī)函數(shù)隨機(jī)分為兩組，其中治療組45例，采用膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射臭氧治療；對照組32例，采用膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射滅菌空氣治療。兩組在年齡、性別比、病程、側(cè)別、治療前VAS評分與LKSS評分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。該研究已通過泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校及解放軍第910醫(yī)院倫理管理委員會審核，患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

遵循2008年中華醫(yī)學(xué)會骨科學(xué)分會修訂的膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]：近1個(gè)月內(nèi)反復(fù)膝關(guān)節(jié)疼痛；影像學(xué)包括站立位X線片提示關(guān)節(jié)間隙變窄、軟骨下骨硬化和/或囊性變、關(guān)節(jié)緣骨刺形成；關(guān)節(jié)液（2次及以上）清亮、黏稠，WBC＜2 000個(gè)/mL；中老年（≥50歲）；晨僵≤30 min；活動時(shí)有骨摩擦感（音）。綜合以上各項(xiàng)，符合+或+++或+++即可診斷為膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.4 治療方法

患者取平臥位，以髕骨下緣的水平線與髕骨外緣或內(nèi)緣的垂直交點(diǎn)為穿刺點(diǎn)，經(jīng)穿刺點(diǎn)向內(nèi)或向外進(jìn)針入關(guān)節(jié)腔，也可經(jīng)髕韌帶的任何一側(cè)、緊貼髕骨下方向后進(jìn)針。治療組：采用醫(yī)用臭氧發(fā)生器（赫爾曼公司，德國）制備臭氧，用一次性注射器抽取濃度為40 g/mL的醫(yī)用臭氧20 mL注入，穿刺處無菌輔料覆蓋并稍按壓10 min。每周注射1次，5周為一療程。對照組：采用小型空氣滅菌器（東信高科有限公司提供，型號：TS-01）制備滅菌空氣，用一次性注射器抽取滅菌空氣20 mL注入膝關(guān)節(jié)腔。每周注射1次，5周為一療程。

1.5 標(biāo)本采集與檢測方法

標(biāo)本采集和保存方法：從髕骨上方、股四頭肌腱外側(cè)采用注射器抽取關(guān)節(jié)液1～3mL，并留于血清管中，2 h內(nèi)在4 500轉(zhuǎn)/min條件下離心 10 min，留取上清液分裝于Eppendorf管中，快速冷凍，置于-70℃低溫冰箱保存待測。

檢測方法：采用TNF-酶聯(lián)免疫試劑盒（上海嵐派生物科技有限公司提供）檢測醫(yī)用臭氧治療前（治療前）及治療后第1～12周每周的關(guān)節(jié)液中TNF-含量。

1.6 觀察指標(biāo)

采用疼痛視覺模擬評分（VAS）記錄治療前與治療后第1～12周每周的疼痛情況，0分表示沒有疼痛，10分表示劇烈疼痛。膝關(guān)節(jié)功能評分采用 Lysholm膝關(guān)節(jié)評分量表（Lysholmknee score scale，LKSS），正常為100分，分值越小，表示功能障礙越嚴(yán)重。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。兩組間各時(shí)間點(diǎn)的TNF-含量比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；治療組治療前、后的TNF-含量、VAS評分與LKSS評分比較分別采用單因素方差分析；治療組TNF-含量與VAS、LKSS的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

所有77例患者均獲得隨訪，隨訪時(shí)間6～27個(gè)月，平均（15.66±6.92）個(gè)月。

2.1 兩組間各時(shí)間點(diǎn)TNF-含量比較

治療組臭氧治療后第1周與第2周的TNF-含量與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；第3～12周，治療組的 TNF-含量逐漸下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。具體數(shù)據(jù)見表1、圖1。

表1 治療組與對照組各時(shí)間點(diǎn)的TNF-含量比較（ g/mL）

圖1 治療組與對照組各時(shí)間點(diǎn)的TNF-含量曲線圖

2.2 治療組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)間的TNF-含量比較

治療組內(nèi)治療前與第1周、第1周與第2周、第10周與第11周、第11周與第12周的TNF-含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而第2～10周間各時(shí)間點(diǎn)的TNF-含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。具體內(nèi)容見圖2。

圖2 治療組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)間的TNF-含量比較：表示兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)間的TNF-含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；●表示兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)間的TNF-含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）

2.3 治療組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)間的VAS評分變化

治療組內(nèi)治療前與第1周、第1周與第2周的VAS評分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余各時(shí)間點(diǎn)的VAS評分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。具體數(shù)據(jù)見圖3。

圖3 治療組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)間的VAS評分比較：表示兩個(gè)相鄰時(shí)間點(diǎn)間的VAS比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；●表示兩個(gè)相鄰時(shí)間點(diǎn)間的VAS評分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；▲表示兩個(gè)相鄰時(shí)間點(diǎn)間的VAS評分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

2.4 治療組TNF-含量與VAS評分的相關(guān)性分析

治療組 TNF-含量與 VAS評分呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.657，P=0.001，P＜0.01（見圖 4）。

圖4 治療組TNF-含量與VAS評分相關(guān)性分析

2.5 治療組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)間的LKSS評分變化

治療組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)間的LKSS評分比較見圖5。

圖5 治療組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)間的LKSS評分比較：表示兩個(gè)相鄰時(shí)間點(diǎn)間的LKSS比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；●表示兩個(gè)相鄰時(shí)間點(diǎn)間的LKSS評分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）

2.6 治療組內(nèi)TNF-含量與LKSS評分的相關(guān)性分析

治療組內(nèi)TNF-含量與LKSS評分呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.701，P=0.001，P＜0.01（見圖 6）。

圖6 治療組內(nèi)TNF-含量與LKSS評分相關(guān)性分析

2.7 不良反應(yīng)

所有患者均未出現(xiàn)注射后膝關(guān)節(jié)疼痛加重或紅腫、皮溫升高等炎癥反應(yīng)，無一例出現(xiàn)穿刺點(diǎn)感染。

3 討論

3.1 TNF-與骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)系

骨性關(guān)節(jié)炎以關(guān)節(jié)軟骨退行性改變?yōu)榛A(chǔ)病變，雖然至今其確切發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但多種炎性因子參與其中。其中，TNF-是主要的炎性介導(dǎo)因子，它可以通過介導(dǎo)IL、LRG1、MKK4等炎性因子或直接通過抑制 RNA表達(dá)加速軟骨細(xì)胞的凋亡，繼而促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨的退變[3-5]。Fryer等 [6]的研究證實(shí)，膝關(guān)節(jié)液中 TNF-濃度與關(guān)節(jié)理化病變有關(guān)，提示TNF-可能是骨性關(guān)節(jié)炎病理過程中的主要炎性因子，對關(guān)節(jié)軟骨破壞起到重要的中介作用。由于TNF-在骨性關(guān)節(jié)炎病理過程中的重要作用，F(xiàn)lemming等[7]認(rèn)為TNF-可以作為衡量OA嚴(yán)重程度的輔助標(biāo)準(zhǔn)之一，通過TNF-含量的變化，可以反映OA病情進(jìn)展和治療效果，但該觀點(diǎn)尚需更多的證據(jù)支持。

3.2 臭氧對TNF-水平的影響

目前，膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的階梯治療主要包括理療、非甾體類抗炎鎮(zhèn)痛藥與軟骨營養(yǎng)藥、玻璃酸鈉及手術(shù)治療等，但臭氧療法作為近年來新興的一種治療方法，在臨床上和實(shí)驗(yàn)中取得了一定的治療效果 [8-9]。但其作用機(jī)理尚未完全明確，可能與臭氧的強(qiáng)氧化作用有關(guān)，在人體內(nèi)可能通過中和或抑制多種炎性介質(zhì)及致炎物質(zhì)的合成、釋放，產(chǎn)生抗炎、鎮(zhèn)痛、改善關(guān)節(jié)功能的作用 [10]。雖然臭氧治療過程的TNF-途徑是其可能作用機(jī)制之一，但該過程中TNF-如何變化及對膝關(guān)節(jié)功能的影響尚無文獻(xiàn)報(bào)道。所以本實(shí)驗(yàn)旨在研究膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎臭氧治療過程中的TNF-含量變化情況，以及TNF-與疼痛和膝關(guān)節(jié)功能的相關(guān)性。

本研究中，臭氧治療第1周與第2周時(shí)與對照組的TNF-含量比較無差異，而從第3周后，治療組的TNF-含量持續(xù)下降。這種原因可能是膝關(guān)節(jié)腔注射臭氧后，臭氧并非直接抑制滑膜細(xì)胞TNF-的表達(dá)，可能還需要某些中介途徑，從注射臭氧到TNF-表達(dá)獲得抑制需要一定的時(shí)間，本研究發(fā)現(xiàn)這個(gè)時(shí)間間隔為2周。所以在進(jìn)行臭氧治療時(shí)，臨床醫(yī)師應(yīng)向患者介紹這種療法存在約2周的起效準(zhǔn)備期，增加患者的治療依從性。而經(jīng)過2周的準(zhǔn)備期后，滑膜細(xì)胞的TNF-表達(dá)開始出現(xiàn)抑制，體現(xiàn)為關(guān)節(jié)液中的TNF-含量持續(xù)明顯下降，第3周以后各時(shí)間點(diǎn)的TNF-含量均低于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這也證實(shí)Noori-Zadeh等關(guān)于臭氧療法可以影響骨性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液中的TNF-水平的推測 [11]。而且這種影響不止體現(xiàn)在治療期，在臭氧治療結(jié)束后第6～10周各時(shí)間點(diǎn)的 TNF-含量仍持續(xù)下降，說明臭氧對TNF-表達(dá)的抑制存在一個(gè)較長的延遲效應(yīng)期，可以在臭氧治療結(jié)束后繼續(xù)對關(guān)節(jié)液中的TNF-水平施加影響，這是目前文獻(xiàn)尚未報(bào)道的。但在第11周與第12周時(shí)，TNF-含量變化再次進(jìn)入平臺期，兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的TNF-含量下降開始放緩，比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這說明臭氧對TNF-的抑制在第11、12周時(shí)開始減弱，但由于該研究的隨訪時(shí)間較短，無法明確第12周以后的TNF-水平維持的時(shí)間，尚需進(jìn)一步研究。所以在進(jìn)行臭氧治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎時(shí)，應(yīng)了解臭氧對TNF-的影響具有2周的起效準(zhǔn)備期，而起效后可以存在至少10周的效應(yīng)期。

3.3 TNF-對OA膝關(guān)節(jié)功能的影響

TNF-對關(guān)節(jié)軟骨與關(guān)節(jié)滑膜的影響及與疼痛的關(guān)系已有較多文獻(xiàn)報(bào)道。Nees等[12]發(fā)現(xiàn)TNF-可促進(jìn)滑膜成纖維細(xì)胞樣增殖，增強(qiáng)滑膜細(xì)胞RNA的表達(dá)功能，而成為滑膜組織纖維化及滑液中細(xì)胞因子水平異常升高的誘導(dǎo)因素之一，這一因素可能改變關(guān)節(jié)軟骨的微環(huán)境，從而導(dǎo)致OA的靜息性疼痛。Shore[13]的研究顯示TNF-誘導(dǎo)的蛋白激酶CK2途徑導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的凋亡和軟骨基質(zhì)的溶解，在OA運(yùn)動性疼痛中起到重要的作用。雖然OA引起的疼痛是在許多因素共同作用下產(chǎn)生的，但臭氧介導(dǎo)的TNF-水平變化對疼痛的影響在該研究中獲得證實(shí)。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著TNF-水平的下降，相應(yīng)的膝關(guān)節(jié)VAS評分也隨之下降，兩者之間具有正相關(guān)性，臭氧通過抑制TNF-表達(dá)的途徑參與了疼痛的控制，而且VAS評分的變化與TNF-類似，VAS評分在開始治療的第1周和第2周變化不明顯，但從第3周開始VAS評分持續(xù)下降，這可能與臭氧對 TNF-的變化有延遲效應(yīng)有關(guān)。但該研究無法判斷臭氧療法的疼痛控制是由TNF-完全主導(dǎo)或占據(jù)多大的作用，因?yàn)樵诘?1周與第12周這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，雖然TNF-的變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但VAS評分水平仍持續(xù)下降，這個(gè)過程中可能還會有其他疼痛介導(dǎo)途徑參與，還需要對這些疼痛介導(dǎo)途徑進(jìn)一步研究。

與疼痛控制不同的是，臭氧療法對膝關(guān)節(jié)功能的影響非常滯后。TNF-與膝關(guān)節(jié)的LKSS功能評分雖然存在負(fù)相關(guān)的關(guān)系，TNF-途徑對膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的功能康復(fù)具有一定的作用，但LKSS評分在治療的前6周變化不明顯，而需要到第7周開始才會改善，功能改善的延遲性非常明顯，這說明在臭氧治療中TNF-途徑并非完全主導(dǎo)，尚有其他途徑參與。臭氧治療對膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎具有良好的療效，治療后第12周的LKSS功能評分達(dá)到（89.11±2.71）分，但TNF-在膝關(guān)節(jié)功能恢復(fù)中可能只起到部分作用。

3.4 不足之處

綜上所述，臭氧療法可以抑制膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞TNF-的表達(dá)，該途徑在早期疼痛控制中具有重要作用，但在關(guān)節(jié)功能恢復(fù)中可能不起主導(dǎo)作用，而且遠(yuǎn)期是否對膝關(guān)節(jié)疼痛仍具有控制作用尚需進(jìn)一步研究。