趙勇，徐巖，姬婷婷

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬阜陽(yáng)醫(yī)院，安徽阜陽(yáng)236000)

急性心肌缺血可直接導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡，再灌注后也會(huì)引起心肌細(xì)胞凋亡[1]。急性心肌缺血?jiǎng)游飳?shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞凋亡主要發(fā)生在缺血壞死區(qū)域周圍，可促進(jìn)梗死面積的擴(kuò)大[2]。因此，減輕缺血再灌注損傷所致心肌細(xì)胞凋亡對(duì)于減小梗死面積具有重要意義。在心肌組織中Toll樣受體(TLRs)主要表達(dá)TLR2和TLR4，而TLR4/NF-κB信號(hào)通路是參與細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)通路之一[3,4]。β-arrestin2為NF-κB的調(diào)控蛋白，參與TLR4/NF-κB信號(hào)通路調(diào)控?？ňS地洛為第三代β受體阻滯劑，在非選擇性阻斷β受體的同時(shí)，還選擇性阻斷α1受體，并具有鈣拮抗作用，能顯著改善心肌梗死、心衰患者的預(yù)后，但是其作用機(jī)制相關(guān)報(bào)道較少[5]。2015年11月～2017年11月，本研究觀察了不同濃度卡維地洛預(yù)處理對(duì)缺氧/復(fù)氧后心肌細(xì)胞凋亡的影響，并探討其機(jī)制是否與β-arrestin2及TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：心肌H9C2細(xì)胞(簡(jiǎn)稱H9C2細(xì)胞)由安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供。主要藥品及試劑：卡維地洛購(gòu)于山東齊魯制藥有限公司，胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司，SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、RIPA細(xì)胞裂解液購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司，電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Pierce公司，TLR4封閉抗體購(gòu)于德國(guó)CST公司，熒光測(cè)定TUNEL凋亡檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)Promega公司。主要儀器：EPS300型電泳儀購(gòu)于上海天能科技有限公司，熒光定量PCR儀ABI7500購(gòu)于美國(guó)ABI公司，Modulus多功能光度計(jì)購(gòu)于美國(guó)BioSystems公司，倒置熒光顯微鏡購(gòu)于日本Olympus公司。

1.2 細(xì)胞分組處理 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞分為模型組、低劑量卡維地洛組、中劑量卡維地洛組、高劑量卡維地洛組、TLR4封閉抗體組和對(duì)照組。對(duì)照組在37 ℃、5% CO2的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，常規(guī)換液，其余各組參照Esumi等[6]的方法建立細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型。低、中、高劑量卡維地洛組及TLR4封閉抗體組分別在缺氧/復(fù)氧損傷前30 min加入1、5、10 μmol/L卡維地洛及20 μg/mL TLR4封閉抗體進(jìn)行預(yù)處理。

1.3 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 采用TUNEL法。取各組細(xì)胞，加入配置好的TUNEL檢測(cè)液，制成載玻片。在熒光顯微鏡下分析樣本，用標(biāo)準(zhǔn)的熒光過濾裝置在(520±20)nm波長(zhǎng)下觀察熒光素-12-dUTP摻入并定位的綠色熒光，>620 nm波長(zhǎng)下觀察碘化丙啶定位的紅色熒光。紅色熒光表示存活細(xì)胞與凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核，綠色熒光表示凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核。計(jì)數(shù)視野內(nèi)的凋亡細(xì)胞與總細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.4 凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。取各組細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度；配制SDS-PAGE凝膠，以每孔25 μg等質(zhì)量上樣，濃縮膠所用電壓為80 V，時(shí)間為30 min；分離膠所用電壓為120 V，時(shí)間為1 h；待溴酚藍(lán)剛跑出時(shí)終止電泳。采用半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h；加入一抗(1∶1 000)孵育過夜，TBST洗膜3次，加入二抗(1∶10 000)孵育，TBST洗膜3次，ECL顯色。以β-actin作為內(nèi)參，采用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算目的條帶與內(nèi)參條帶灰度值的比值。

1.5 TLR4、NF-κB、β-arrestin2 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取各組細(xì)胞，加入TRIzol試劑提取總RNA，微量核酸定量?jī)x定量檢測(cè)各樣本RNA濃度及純度合格后，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄RNA合成cDNA。TLR4上游引物5′-TCATGCTTTCTCACGGCCTC-3′，下游引物5′-AGGAAGTACCTCTATGCAGGGAT-3′，引物長(zhǎng)度142 bp；NF-кB上游引物5′-ACGATCTGTTTCCCCTCATC-3′，下游引物5′-TGCTTCTCTCCCCAGGAATA-3′，引物長(zhǎng)度150 bp；β-arrestin2上游引物5′-CACAAAAGGAACTCCGTGCG-3′，下游引物5′-AGACATGAGGAAGTGGCGTG-3′，引物長(zhǎng)度105 bp；內(nèi)參β-actin上游引物5′-CGCGAGTACAACCTTCTTGC-3′，下游引物5′-CGTCATCCATGGCGAACTGG-3′，引物長(zhǎng)度70 bp。PCR反應(yīng)體系20 μL： 2×Goldstar Taqman mixture 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，Probe 0.4 μL，模板DNA 2 μL，Rnase Free water 6.8 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，退火15 s，60 ℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算TLR4、NF-κB、β-arrestin2 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞凋亡率及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，其余各組細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)均升高，Bcl-2蛋白表達(dá)降低，以模型組變化最明顯(P均<0.05)。低、中、高劑量卡維地洛組細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)均依次降低，Bcl-2蛋白表達(dá)均依次升高(P均<0.05)。見表1、圖1。

表1 各組細(xì)胞凋亡率及Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與低劑量卡維地洛組比較，cP<0.05；與中劑量卡維地洛組比較，dP<0.05。

注：A為對(duì)照組，B為模型組，C為低劑量卡維地洛組，D為中劑量卡維地洛組，E為高劑量卡維地洛組，F(xiàn)為TLR4封閉抗體組。

圖1各組Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)情況(Western blotting法)

2.2 各組TLR4、NF-κB、β-arrestin2 mRNA表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，模型組TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)均升高，β-arrestin2 mRNA表達(dá)均降低，TLR4封閉抗體組NF-κB mRNA表達(dá)降低(P均<0.05)。與模型組比較，TLR4封閉抗體組及低、中、高劑量卡維地洛組TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)均降低，TLR4封閉抗體組及高劑量卡維地洛組β-arrestin2 mRNA表達(dá)均升高(P均<0.05)。與低劑量卡維地洛組比較，中、高劑量卡維地洛組TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)均降低，β-arrestin2 mRNA表達(dá)均升高(P均<0.05)。見表2。

表2 各組TLR4、NF-κB、β-arrestin2 mRNA表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與低劑量卡維地洛組比較，cP<0.05；與中劑量卡維地洛組比較，dP<0.05。

3 討論

心肌再灌注是治療急性心肌梗死的重要措施，但隨著心肌細(xì)胞缺血情況的改善，再灌注損傷成為患者預(yù)后不良的重要原因[7,8]。Gottlieb等[9]在家兔離體心臟再灌注模型中發(fā)現(xiàn)，家兔心臟缺血30 min、4.5 h時(shí)均無細(xì)胞凋亡發(fā)生，而缺血30 min再灌注4 h后出現(xiàn)明顯的心肌細(xì)胞凋亡?？ňS地洛是一種新型非選擇性腎上腺素能受體阻滯劑，可以阻斷β1、β2和α1受體，且不增加心肌對(duì)兒茶酚胺的敏感性，具有良好的無內(nèi)在擬交感活性、極強(qiáng)的抗氧化損傷作用等?？ňS地洛對(duì)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的影響可以通過多種通路進(jìn)行，如下調(diào)miRNA表達(dá)、抑制AKT/XIAP信號(hào)通路等[10,11]。但是，卡維地洛減輕心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的分子機(jī)制尚不清楚。

Bcl-2家族蛋白是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)與凋亡有關(guān)的蛋白，該家族蛋白具有很多同源基因或蛋白，其中研究比較廣泛的是具有抑制細(xì)胞凋亡作用的Bcl-2、McLI、Al、Befl以及具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用的Bax、Bad、Bik等。研究表明，Bcl-2可通過直接抗氧化作用[12]、抑制Caspase激活[13]、維持細(xì)胞內(nèi)鈣平衡、抑制核酸內(nèi)切酶等途徑抑制細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，其余各組細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)均升高，Bcl-2蛋白表達(dá)均降低，以模型組變化最明顯，而低、中、高劑量卡維地洛組細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)均依次降低，Bcl-2蛋白表達(dá)均依次升高；這說明卡維地洛可減輕H9C2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧造成的細(xì)胞凋亡，并具有濃度相關(guān)性。

TLR4是人類發(fā)現(xiàn)的首個(gè)TLRs相關(guān)蛋白，幾乎在所有細(xì)胞中均有表達(dá)，并參與動(dòng)脈粥樣硬化、血栓、心肌重構(gòu)、缺血再灌注損傷甚至瓣膜性疾病等心血管疾病的病理過程。TLR4被激活后啟動(dòng)信號(hào)通路，轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)并活化NF-κB；而NF-κB是調(diào)控多種基因轉(zhuǎn)錄的重要因子，在細(xì)胞凋亡調(diào)控、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[14]。β-arrestin2是NF-κB的負(fù)調(diào)控因子，可招募CARMA3到溶血磷脂酸(LPA)受體，在GPCR介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用[15]。本研究結(jié)果顯示，TLR4封閉抗體組細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)均低于模型組，Bcl-2蛋白表達(dá)高于模型組，說明凋亡相關(guān)蛋白Bcl2、Bax表達(dá)受TLR4信號(hào)通路調(diào)控，TLR4信號(hào)通路參與了心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧過程中的細(xì)胞凋亡；模型組TLR4和NF-κB mRNA表達(dá)明顯高于對(duì)照組，而TLR4封閉抗體組TLR4和NF-κB mRNA表達(dá)均低于模型組，β-arrestin2 mRNA表達(dá)高于模型組;結(jié)合細(xì)胞凋亡結(jié)果，證實(shí)β-arrestin2對(duì)TLR4具有負(fù)調(diào)節(jié)作用,且TLR4/NF-κB信號(hào)通路與缺氧/復(fù)氧損傷導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究中，低、中、高劑量卡維地洛組TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)均低于模型組，以中、高劑量卡維地洛組變化更明顯，說明中等劑量的卡維地洛即可抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路；但是，低、中、高劑量卡維地洛組β-arrestin2 mRNA表達(dá)逐漸升高，與TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)變化并不同步，說明卡維地洛既可以直接抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路，又可通過增加β-arrestin2表達(dá)而負(fù)調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路。

綜上所述，卡維地洛預(yù)處理能夠減輕缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞凋亡，并呈濃度相關(guān)性，其機(jī)制可能與升高β-arrestin2表達(dá)及抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。