梁濱，肖永生，李榮霖

(天津市寧河區(qū)醫(yī)院，天津301500)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其臨床治療方法主要以外科手術(shù)為主，并輔助放療、化療等[1]。放、化療藥物在某種程度上能夠抑制乳腺癌的發(fā)展，但其不良反應(yīng)較大，在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)對(duì)機(jī)體正常細(xì)胞也會(huì)造成損傷，并且易產(chǎn)生耐藥性[2,3]。因此，從天然產(chǎn)物中尋找高效且不良反應(yīng)小的抗乳腺癌藥物是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。山奈素是一種在高等植物中廣泛存在的黃酮類化合物，具有降血壓、降血脂、祛痰等多種功效。目前，山奈素對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其相關(guān)機(jī)制均鮮見報(bào)道。為此，我們于2018年6月～2019年4月進(jìn)行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 材料 乳腺癌MCF7細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。山奈素購(gòu)于上海純優(yōu)生物科技有限公司，有絲分裂原活化蛋白激酶(Ras/Raf/MEK/ERK)信號(hào)通路抑制劑索拉菲尼(sorafenib)購(gòu)于美國(guó)Glpbio公司，Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路激活劑ML-099購(gòu)于上海偉寰生物科技有限公司，Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購(gòu)于北京雷根生物技術(shù)有限公司，RIPA裂解液和BCA蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)于中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所，磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(p-Raf-1)、磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(p-ERK)、細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出MCF7細(xì)胞凍存管，37 ℃水浴快速融合，轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中。加入適量PBS混勻，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。加入適量PRMI1640培養(yǎng)基，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。加入適量含10% FBS的PRMI1640培養(yǎng)基，混懸后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)，胰酶消化，傳代培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 山奈素濃度篩選 采用MTT法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×104/mL，每孔200 μL接種于96孔板中，37 ℃、5% CO2、97%濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后分為兩部分，一部分分別加入含終濃度為25、50、75、100 μg/mL山奈素[4]的培養(yǎng)基，另一部分加入等量PRMI1640培養(yǎng)基。兩部分細(xì)胞分別于培養(yǎng)12、24、48、72 h，每孔加入濃度為5 g/L的MTT溶液20 μL，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h。吸棄培養(yǎng)基，每孔加入二甲基亞砜溶液150 μL，孵育5 min，混合均勻。于全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的光密度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。結(jié)果顯示，加入75 μg/mL山奈素作用48 h后細(xì)胞增殖抑制率為54.39%±1.73%，達(dá)到半數(shù)有效劑量。因此，選擇75 μg/mL山奈素作用48 h作為后續(xù)研究的實(shí)驗(yàn)條件。

1.4 細(xì)胞分組處理 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF7細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后分為山奈素組、sorafenib組、ML-099+山奈素組、空白對(duì)照組，分別加入含75 μg/mL山奈素的培養(yǎng)基、含10 μmol/L sorafenib[5]的培養(yǎng)基、含5 μmol/L ML-099[6]與75 μg/mL山奈素的培養(yǎng)基、等量PRMI1640培養(yǎng)基。

1.5 細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè) 各組培養(yǎng)48 h，參照1.3采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率。

1.6 細(xì)胞凋亡能力檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。各組培養(yǎng)48 h，吸棄上清液，預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞，胰酶消化后收集細(xì)胞。調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL,取0.5 mL細(xì)胞懸液于1.5 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清液。加入195 μL的Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，再加入5 μL的Annexin V-FITC結(jié)合液，輕輕吹打均勻，室溫條件下避光反應(yīng)15 min。1 000 r/min離心5 min，棄上清液。加入190 μL的Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，再加入10 μL PI，輕輕吹打均勻，冰浴避光反應(yīng)15 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.7 細(xì)胞Raf-1、ERK、Cyclin D1、Caspase-3 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。各組培養(yǎng)48 h，胰酶消化并收集細(xì)胞。PBS清洗，加入TRIzol試劑提取總RNA。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA純度和濃度合格后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Raf-1上游引物5′-GGAGCTTGGAAGACGATCAG-3′，下游引物5′-CTCCGTGCCATTTACCCTTA-3′，引物長(zhǎng)度1 096 bp；ERK上游引物5′-TCATAGGCATCCGAGACATC-3′，下游引物5′-TGGTAGAGGAAGTAGCAGA TG-3′，引物長(zhǎng)度186 bp；Cyclin D1上游引物5′-GCATGTTCGTGGCCTCTAAGA-3′，下游引物5′-CGGTGTAGATGCACAGCTTCTC-3′，引物長(zhǎng)度246 bp；Caspase-3上游引物5′-AAAGTGCCTGGACGCGCGTT-3′，下游引物5′-AGTGGGCCGCCTGGAGAGG-3′，引物長(zhǎng)度238 bp；內(nèi)參β-actin上游引物5′-CTGGGACGACATGGACAAAA-3′，下游引物5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′，引物長(zhǎng)度180 bp。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃、10 min，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，共45個(gè)循環(huán)。采用 2-ΔΔCt法計(jì)算Raf-1、ERK、Cyclin D1、Caspase-3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.8 p-Raf-1、p-ERK、Cyclin D1、Caspase-3蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。各組培養(yǎng)48 h，胰酶消化并收集細(xì)胞。PBS清洗后，加入不含蛋白酶的RIPA裂解液，置于冰上裂解，時(shí)間30 min。4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，收集上清液即為蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取等量蛋白，加入上樣緩沖液，煮沸5 min，蛋白變性后行SDS-PAGE電泳。將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。分別加入p-Raf-1(1∶600)、p-ERK(1∶800)、Cyclin D1(1∶400)和Caspase-3(1∶200)一抗，4 ℃孵育12 h。次日洗膜后，加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的IgG(1∶200)，室溫孵育1 h。再次洗膜，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，避光顯影，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。采用Image Pro Plus6.0軟件分析蛋白條帶的灰度值。以β-actin為內(nèi)參，以目的蛋白與β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率及細(xì)胞凋亡率比較 見表1。

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率及細(xì)胞凋亡率比較

注：與山奈素組比較，*P<0.05；與sorafenib組比較，#P<0.05；與ML-099+山奈素組比較，△P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞Raf-1、ERK、Cyclin D1、Caspase-3 mRNA表達(dá)比較 見表2。

表2 各組細(xì)胞Raf-1、ERK、Cyclin D1、Caspase-3 mRNA相對(duì)比表達(dá)量比較

注：與山奈素組比較，*P<0.05；與sorafenib組比較，#P<0.05；與ML-099+山奈素組比較，△P<0.05。

2.3 各組細(xì)胞p-Raf-1、p-ERK、Cyclin D1、Caspase-3蛋白表達(dá)比較 見表3。

表3 各組細(xì)胞p-Raf-1、p-ERK、Cyclin D1、Caspase-3蛋白相對(duì)比表達(dá)量比較

注：與山奈素組比較，*P<0.05；與sorafenib組比較，#P<0.05；與ML-099+山奈素組比較，△P<0.05。

3 討論

乳腺癌具有較高的發(fā)病率和病死率，已成為嚴(yán)重威脅女性健康的“頭號(hào)殺手”。近年來(lái)乳腺癌患者的治療效果有了較大改善，但放、化療藥物具有較大的不良反應(yīng)和腫瘤耐藥性，因此尋找新的高效、低毒藥物成為研究者們關(guān)注的熱點(diǎn)[7]。研究顯示，從天然植物中提取的黃酮類化合物具有較好的抗腫瘤作用，如槲皮素可通過(guò)抑制STAT通路抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡[8,9]。木犀草素可能通過(guò)激活p53信號(hào)通路、上調(diào)miR-34a-5p表達(dá)，發(fā)揮抑制肺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的作用[10]。芹菜素可抑制乳腺癌多藥耐藥MCF-7/ADR細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，具有逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的作用[11]。山奈素作為一種黃酮類化合物，也表現(xiàn)出了一定的抗腫瘤作用，但目前其對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用機(jī)制鮮見報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，山奈素可抑制乳腺癌MCF7細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，具有濃度和時(shí)間相關(guān)性，提示山奈素可能是乳腺癌治療的潛在藥物。其中加入75 μg/mL山奈素作用48 h后細(xì)胞增殖抑制率為54.39%±1.73%，達(dá)到半數(shù)有效劑量，因此選擇75 μg/mL山奈素作用48 h作為后續(xù)研究的實(shí)驗(yàn)條件。

Raf-1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與促進(jìn)有絲分裂信號(hào)從細(xì)胞膜到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)導(dǎo)，在細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用，與腫瘤發(fā)生、細(xì)胞周期調(diào)控及細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)[12]。ERK屬于酪氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，有ERK1和ERK2兩種亞型。MEK屬于MAP2K家族成員，其作用是磷酸化并激活下游底物ERK1/2[13]。Cyclin D1是調(diào)控細(xì)胞周期G1期的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)升高可促使細(xì)胞由G1期向S轉(zhuǎn)換，促進(jìn)細(xì)胞增殖[14]。Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)參與細(xì)胞的凋亡過(guò)程，Caspase-3是細(xì)胞凋亡的“執(zhí)行者”，其表達(dá)升高可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[16,17]。Ras募集并激活Raf，激活后的Raf可促進(jìn)MEK1/2和ERK1/2激活，激活后的ERK1/2可調(diào)節(jié)多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，引起不同基因表達(dá)。Raf/MEK/ERK通路激活后，p-Raf-1、p-MEK、p-ERK蛋白表達(dá)增加，促進(jìn)Cyclin D1與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合體并激活CDK，加速細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖，引起腫瘤發(fā)生[18]。本研究結(jié)果顯示，sorafenib 組細(xì)胞增殖抑制率及細(xì)胞凋亡率均高于空白對(duì)照組，說(shuō)明Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路參與了乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展；山奈素組細(xì)胞Raf-1、ERK、Cyclin D1 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于ML-099+山奈素組、空白對(duì)照組，Caspase-3 mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于ML-099+山奈素組、空白對(duì)照組，說(shuō)明山奈素可下調(diào)乳腺癌細(xì)胞Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路相關(guān)基因和蛋白表達(dá)，Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路激活劑的加入可降低山奈素對(duì)該信號(hào)通路的影響。因此，抑制Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路可能是山奈素抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡的機(jī)制之一。

綜上所述，山奈素能在一定程度上抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)其凋亡，其可能通過(guò)抑制Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的激活而發(fā)揮作用，是乳腺癌治療的潛在藥物。但是，山奈素是否通過(guò)其他通路發(fā)揮抗乳腺癌作用仍有待深入研究。