蔣春艷，陳木興，謝麗平，林濤發(fā)，王少揚

(1蚌埠醫(yī)學院?？偨虒W醫(yī)院，福州350000；2中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院)

原發(fā)性肝細胞癌(HCC)被列為全世界癌癥相關死亡的第二大原因，我國HCC發(fā)病及死亡人數(shù)在全世界范圍內占比均為50%左右[1]。當肝細胞發(fā)生癌變時，癌周結構和細胞群體均發(fā)生改變，這種惡性細胞與周圍非惡性基質之間的結構成分和動態(tài)相互作用被稱為腫瘤微環(huán)境[2]。免疫細胞分布和功能異常是HCC發(fā)生和發(fā)展的重要機制，也是HCC微環(huán)境改變的主要特征。調節(jié)性T細胞(Tregs)是腫瘤微環(huán)境中的重要免疫調節(jié)成分，具有獨特的免疫抑制能力，可以削弱機體的抗腫瘤能力，協(xié)助腫瘤細胞完成免疫逃逸[3]。LAP+CD4+T細胞是新發(fā)現(xiàn)的一種Tregs亞群[4]，具有比經典CD4+CD25+Foxp3+T細胞更強的腫瘤抑制活性[5]。有研究表明，LAP+CD4+T細胞具有比LAP-CD4+T細胞更高的腫瘤組織歸巢傾向，提示LAP+CD4+T細胞可能參與了腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[6]。但是關于LAP+CD4+T細胞比例在HCC腫瘤微環(huán)境中的變化及臨床意義鮮有報道。為此，本研究觀察了HCC患者癌組織中LAP+CD4+T細胞比例變化，并分析其與患者臨床病理參數(shù)的關系?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2017年12月～2018年10月于中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院進行初次手術治療的HCC患者30例，男22例、女8例，年齡27～71歲，血清甲胎蛋白(AFP)<200 ng/mL 16例，≥200 ng/mL 14例；AST/ALT<1.0 17例，≥1.0 13例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期21例，Ⅲ～Ⅳ期9例?；颊呔浶g后病理確診為HCC，排除接受過靶向藥物治療、射頻消融、經導管動脈化療栓塞及免疫治療等抗腫瘤治療的患者，合并自身免疫性疾病的患者。本研究通過中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊第九〇〇醫(yī)院倫理委員會審核，患者均簽署知情同意書。

1.2 組織LAP+CD4+T細胞比例檢測 選取患者術中切除的新鮮癌組織及距腫瘤2 cm處相應的癌旁組織(大小約為2 cm×1 cm×1 cm)，去除壞死組織、脂肪及其他正常組織。眼科剪剪碎，置入配制好的組織消化液中，37 ℃條件下恒溫震蕩消化1 h。70 μm一次性細胞濾網(wǎng)濾過，將濾液吸至15 mL離心管中，25 ℃條件下1 500 r/min離心10 min，吸去上層清液，沉淀中加入PBS 4 mL重懸，制備細胞懸液。各取100%和75% ficoll-hypaque淋巴分離液(北京索萊寶生物有限公司)2 mL，依次緩慢加至另一個15 mL離心管中，于最上層加入細胞懸液4 mL，25 ℃條件下2 000 r/min離心35 min，一次性無菌吸管收集100%和75% ficoll-hypaque淋巴分離液之間的云霧狀細胞層。加入PBS 3 mL，1 500 r/min離心10 min，25 ℃條件下洗滌2次。加入1%BSA重懸，調整細胞密度為2×106/mL。每份標本各取出100 μL分裝于2個EP管中，標記為實驗管與同型對照管。暗室條件下各取5 μL抗CD4、抗LAP抗體(美國eBioscience公司)加入實驗管，同型對照管加入相應同型抗體，暗室中室溫孵育40 min。加入PBS 500 μL，25 ℃條件下2 000 r/min離心6 min，棄上清后重懸。上流式細胞儀(美國BD公司)檢測LAP+CD4+T細胞比例占總CD4+T細胞的百分比，即為LAP+CD4+T細胞比例。分析癌組織LAP+CD4+T細胞比例與患者臨床病理參數(shù)的關系。

2 結果

2.1 HCC患者癌組織及癌旁組織中LAP+CD4+T細胞比例比較 HCC患者癌組織及癌旁組織中LAP+CD4+T細胞比例分別為11.57%±1.59%、5.74%±0.89%，兩者比較P<0.01。

2.2 HCC患者癌組織LAP+CD4+T細胞比例與臨床病理參數(shù)的關系 HCC患者癌組織LAP+CD4+T細胞比例與性別、年齡、血清AFP水平及AST/ALT均無關(P均>0.05)，TNM分期Ⅰ～Ⅱ期的HCC患者癌組織LAP+CD4+T細胞比例低于Ⅲ～Ⅳ期患者(P<0.05)。見表1。

表1 HCC患者癌組織LAP+CD4+ T細胞比例與臨床病理參數(shù)的關系

3 討論

免疫逃逸是正常細胞轉化為惡性細胞，以及惡性細胞隨后存活所必需的關鍵機制。免疫系統(tǒng)可以通過一種叫做免疫編輯的復雜機制來促進癌細胞的形成[7]。在清除階段，轉化后的細胞可以被免疫細胞(如細胞毒T淋巴細胞和自然殺傷細胞)破壞;但在平衡階段，腫瘤細胞可降低其免疫原性，以逃避免疫殺傷機制，最終在逃逸期形成腫瘤。肝臟通過門靜脈不斷暴露在各種高水平的抗原中，肝臟微環(huán)境表現(xiàn)為強大的免疫抑制作用，以防止自身免疫性肝損傷的發(fā)生[9]。在肝臟免疫微環(huán)境中，Tregs和髓源性抑制細胞等免疫調節(jié)細胞發(fā)揮抑制免疫反應作用，從而促進肝臟腫瘤的發(fā)生[8]。鑒于肝臟特殊的免疫環(huán)境，臨床上需要充分研究肝臟腫瘤微環(huán)境中免疫成分的改變，從而進一步明確免疫成分在產生抗腫瘤免疫應答過程中所發(fā)揮的作用。

研究表明，HCC患者癌組織浸潤淋巴細胞中Tregs數(shù)量增加[10]。一項關于肝癌的研究顯示，通過抑制Tregs功能可以增強抗腫瘤免疫應答效應[11]。Tregs在HCC患者血液中的比例明顯升高，而Tregs比例與HCC嚴重程度有關[12,13]。此外，與癌旁組織相比，癌組織Tregs大量聚集后伴隨CD8+T細胞數(shù)量減少[14]。因此，腫瘤浸潤性Tregs數(shù)量增加可能促進了HCC的進展，并有可能與患者預后不良有關。LAP是一種前肽，與TGF-β的氨基末端非共價結合并產生潛伏的TGF-β復合物，從而促進TGF-β1向細胞外基質釋放。此外，潛伏的TGF-β復合物可表達于血小板、樹突狀細胞和Tregs等多種免疫細胞的細胞膜，并參與免疫調節(jié)機制[6]。LAP+CD4+T細胞是人外周血中非Foxp3+陽性抑制細胞的一個新子集，在體外可以抑制其他T細胞增殖，其抑制作用可能由TGF-β和IL-10介導[3]。本研究結果顯示，HCC患者癌組織LAP+CD4+T細胞比例升高，癌組織LAP+CD4+T細胞比例與患者的性別、年齡、血清AFP水平及AST/ALT均無關，但TNM分期Ⅰ～Ⅱ期的患者癌組織LAP+CD4+T細胞比例低于Ⅲ～Ⅳ期患者，說明LAP+CD4+T細胞可能通過其自身免疫抑制性而促進HCC進展。本研究結果顯示，癌組織LAP+CD4+T細胞比例明顯高于癌旁組織，提示LAP+CD4+T細胞具有一定向腫瘤組織歸巢的趨向性;但是,隨著HCC疾病進展，這些細胞是否會在腫瘤微環(huán)境中積累并向外周血釋放仍需進一步觀察。

綜上所述，HCC患者癌組織LAP+CD4+T細胞比例升高，且LAP+CD4+T細胞可能參與了HCC的疾病進展。