趙杰 鐘成鵬 蔡杰 張建軍

對(duì)乙酰氨基酚(APAP)是一種常用的鎮(zhèn)痛解熱藥，盡管在推薦劑量下確認(rèn)了其有效性和安全性，但APAP過(guò)量仍然會(huì)導(dǎo)致肝毒性甚至急性肝功能衰竭(acute liver failure, ALF)[1]。根據(jù)美國(guó)急性肝功能衰竭研究小組的報(bào)告，APAP相關(guān)肝衰竭約占所有成人ALF的46%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)特異性藥物引起的肝損傷[2, 3]。對(duì)于ALF且無(wú)其他治療手段的患者，肝移植是唯一治療選擇[4]，但肝移植治療費(fèi)用昂貴，并且存在肝源短缺等問(wèn)題。因此，探究其病因機(jī)制，尋找合適的治療藥物，有效控制APAP誘導(dǎo)損傷已成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注和亟需解決的問(wèn)題。

研究表明，非編碼RNA，包括微小RNA(microRNA)和長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)參與急性腦部、腎臟損傷中所致的自身結(jié)構(gòu)和功能變化的病理過(guò)程，為APAP相關(guān)肝損傷患者提供了重要的治療選擇[5, 6]。由于多數(shù)LncRNA的結(jié)構(gòu)與mRNA有一定相似性，提示 miRNA可能通過(guò)類似于mRNA 的作用機(jī)制負(fù)性調(diào)控LncRNA的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮一系列生物學(xué)作用[7]。近幾年，關(guān)于miRNA影響細(xì)胞功能的研究逐漸增多，其中LncRNA 核富含豐富的轉(zhuǎn)錄本1(NEAT1)引起了關(guān)注[8]。研究探討了LncRNA NEAT1在APAP誘導(dǎo)急性肝損傷過(guò)程中的作用。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

6～8周齡雄性C57BL/6小鼠8只，均購(gòu)于上海斯萊克動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)所需新鮮APAP以及用于氣體麻醉的異氟烷購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

二、APAP誘導(dǎo)肝損傷模型建立

將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組各4只。將新鮮APAP溶解在預(yù)熱的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)中，小鼠禁食過(guò)夜后，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射APAP(300 mg/kg)，對(duì)照組注射0.9%NaCl溶液。APAP給藥后24 h對(duì)所有實(shí)驗(yàn)小鼠實(shí)施安樂(lè)死，收集血清和肝臟組織，將一部分肝組織立即甲醛固定，其余組織在液氮中快速冷凍并儲(chǔ)存在-80 ℃下備用。

三、小鼠原代肝細(xì)胞提取

用含有膠原酶(Sigma，美國(guó))的平衡鹽溶液灌注肝臟分離原代細(xì)胞。用EGTA緩沖液經(jīng)門(mén)靜脈以5 mL/min的速度灌注肝臟8 min。隨后，用含有膠原酶的灌注緩沖液以5 mL/min灌注肝臟10 min。然后將肝臟在含有膠原酶的消化緩沖液中解離，用70 μm細(xì)胞過(guò)濾器過(guò)濾。以400 r/min離心5 min收集肝細(xì)胞。計(jì)數(shù)分離的肝細(xì)胞并接種在培養(yǎng)板中。在LncRNA NEAT1干預(yù)實(shí)驗(yàn)中，在APAP(5 mM)加入前48 h，運(yùn)用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 (Invitrogen，美國(guó))將LncRNA NEAT1小干擾RNA(吉瑪基因，上海)、相應(yīng)的陰性對(duì)照(吉瑪基因，上海)加入到肝細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

四、血清ALT和AST測(cè)量

使用異氟烷麻醉小鼠，抗凝管眼球取血，立即1 500×g，4℃離心，取上清液，應(yīng)用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)小鼠ALT和AST。

五、組織學(xué)分析

小鼠肝組織用石蠟包埋固定，切成5 μm厚的切片后行蘇木精伊紅(HE)染色，進(jìn)行形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)。

六、RNA分離和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)

使用TRIzol試劑(Invitrogen，美國(guó))從小鼠組織中提取總RNA。用TaqMan miRNA試劑盒(Life Technologies)測(cè)定LncRNA NEAT1的表達(dá)，以Sno202為內(nèi)參。用PrimeScript RT試劑盒(Takara，日本)合成cDNA。用SYBR Premix Ex Taq RT-PCR試劑盒(Takara)通過(guò)qPCR測(cè)定小鼠基因的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。

七、統(tǒng)計(jì)分析

結(jié) 果

一、APAP處理后小鼠肝組織中LncRNA NEAT1表達(dá)

如圖1所示，HE染色結(jié)果表明，APAP處理后對(duì)小鼠肝臟實(shí)質(zhì)造成了嚴(yán)重?fù)p傷。進(jìn)一步檢測(cè)小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶變化，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，APAP處理組小鼠血清中的ALT和AST顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。進(jìn)一步檢測(cè)LncRNA NEAT1的表達(dá)變化。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，APAP處理組小鼠肝組織LncRNA NEAT1的表達(dá)量增加近3倍，(1.027±0.07823)比(2.825±0.2094)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P<0.05)。

二、體外敲低LncRNA NEAT1的表達(dá)加重APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷

分離小鼠原代肝細(xì)胞進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，與體內(nèi)結(jié)果一致，在原代肝細(xì)胞培養(yǎng)基加入APAP刺激24 h后提取RNA，與對(duì)照組相比，LncRNA NEAT1的表達(dá)量增加3倍，(1.131±0.1882)比(3.023±0.3820)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05)。進(jìn)一步使用siRNA敲低肝細(xì)胞LncRNA NEAT1的表達(dá)并加入APAP刺激，結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞上清的ALT、AST顯著增加(表2)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 PBS組和APAP組小鼠肝組織光學(xué)顯微鏡下

組別鼠數(shù)ALT(U/L)AST(U/L)PBS組442.75 ± 2.345.05 ± 4.1APAP組47565 ± 763.37718 ± 901.6t值9.854P值0.001

表2 siRNA組和LncRNA ENAT1-siRNA組小鼠轉(zhuǎn)氨酶比較(±s)

討 論

研究表明，核受體亞家族2組E成員3(NR2E3)蛋白可能通過(guò)調(diào)節(jié)損傷誘導(dǎo)lncRNA和P53蛋白之間相互作用在APAP誘導(dǎo)肝損傷中發(fā)揮重要作用[9]。Zheng等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在APAP誘導(dǎo)肝損傷中肝內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持和修復(fù)過(guò)程中，篩選出的4個(gè)lncRNA可能通過(guò)代謝和凋亡相關(guān)途徑發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，①在APAP處理后小鼠肝組織以及小鼠原代肝細(xì)胞中LncRNA NEAT1表達(dá)均明顯增加，表明APAP細(xì)胞毒性條件下誘導(dǎo)了LncRNA NEAT1表達(dá)。同時(shí)，LncRNA NEAT1可能參與了APAP誘導(dǎo)肝損傷的過(guò)程。②在體外實(shí)驗(yàn)中，用小干擾RNA敲低肝細(xì)胞LncRNA NEAT1的表達(dá)后，加入APAP誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，通過(guò)血清ALT和AST水平驗(yàn)證，LncRNA NEAT1的表達(dá)降低促進(jìn)APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞死亡。以上結(jié)果提示LncRNA NEAT1可能在APAP誘導(dǎo)的肝損傷病理生理過(guò)程起重要的保護(hù)作用，為臨床上治療APAP誘導(dǎo)的肝損傷開(kāi)辟了新思路。

研究證明，LncRNA與miRNA相互作用，參與靶基因的表達(dá)調(diào)控從而參與胞內(nèi)信號(hào)通路在人類多個(gè)器官的損傷中發(fā)揮重要作用[11-12]。在本研究中，LncRNA NEAT1可能通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA參與APAP誘導(dǎo)肝損傷過(guò)程，其具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。LncRNA研究熱點(diǎn)越來(lái)越傾向于操控miRNA體內(nèi)表達(dá)以達(dá)到治療目的，以及運(yùn)用循環(huán)miRNA作為肝損傷的診斷和衡量預(yù)后的生物標(biāo)志物[13]。今后應(yīng)進(jìn)一步研究APAP過(guò)量后LncRNA NEAT1隨時(shí)間的變化關(guān)系，來(lái)驗(yàn)證LncRNA NEAT1是否可成為肝損傷的新生物標(biāo)志物。

總之，LncRNA NEAT1在APAP誘導(dǎo)肝損傷中的保護(hù)作用，為藥物性肝損傷發(fā)病機(jī)制的提供了新的見(jiàn)解。未來(lái)通過(guò)增加LncRNA NEAT1表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)APAP誘導(dǎo)細(xì)胞毒性作用，可能是一種具有前景的治療策略。