張丹琴 楊帆 李勝保

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種慢性肝臟疾病，主要病理特征是彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪病變[1]。NAFLD患者存在腸道菌群失調(diào)，直接影響脂肪的儲存和代謝。Toll樣受體4(TLR4)是Toll樣受體(TLR)家族成員之一，其可通過相關(guān)信號通路介導(dǎo)炎性反應(yīng)[2]。白介素-22(IL-22)是白介素-10(IL-10)家族成員，均是促炎癥因子，參與炎性反應(yīng)和組織修復(fù)[3]。為了探討NAFLD患者腸道菌群變化與TLR4、IL-10、IL-22的相關(guān)性，本文選取我院收治的126例NAFLD患者進(jìn)行研究?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

資料與方法

一、研究對象

選取2016年6月至2018年8月期間我院收治的126例NAFLD患者進(jìn)行研究。所有患者均確診為NAFLD。納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合2010年NAFLD診療指南[4]；排除標(biāo)準(zhǔn)：自身免疫性肝病和病毒性肝炎等引起的脂肪肝；合并嚴(yán)重腦、心、腎等功能障礙；惡性腫瘤；血液系統(tǒng)疾??；免疫系統(tǒng)疾?。唤趹?yīng)用過抗生素、酸奶、微生態(tài)調(diào)節(jié)劑等影響腸道菌群的制劑。

二、一般資料

126例患者中男性68例，女性58例，年齡23～65歲，平均(48.35±6.24)歲，其中單純性非酒精性脂肪肝(NAFL)49例，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)54例，肝硬化23例。對照組為同期進(jìn)行體檢的健康人90例，男性47例，女性43例，年齡24～64歲，平均(48.02±6.09)歲。兩組一般資料具有可比性(P>0.05)。

三、方法

(一)腸道菌群及腸道定植抗力 采集兩組研究對象的新鮮糞便1.5 g，放置于密閉無菌盒中，0.5 h內(nèi)送檢。稱取0.5 g樣本放入有4.5 mL無菌生理鹽水中混合均勻，按照10倍連續(xù)稀釋法分別稀釋至10～9，分別取10～9、10～7、10～5、10～3、10～1稀釋液50 μL依次接種在選擇性培養(yǎng)基上。雙歧桿菌用BS血瓊脂平板，乳酸桿菌用MRSA營養(yǎng)瓊脂平板，腸桿菌用中國蘭瓊脂平板，腸球菌用羊血平板。需氧菌雙歧桿菌、乳酸桿菌放置于35℃孵箱中培養(yǎng)24 h，厭氧菌腸桿菌、腸球菌采用抽氣換氣培養(yǎng)法培養(yǎng)48 h。采用法國生物梅里埃公司ATB半自動微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定。B/E值為雙歧桿菌和腸桿菌數(shù)量的比值，代表腸道定植抗力。

(二)血清TLR4、IL-10、IL-22檢測 抽取所有研究對象清晨空腹靜脈血4 mL，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測IL-10、IL-17和IL-23。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。血清TLR4、IL-10、IL-22水平為計(jì)量資料，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)性分析和logistic多元回歸分析進(jìn)行影響因素分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，當(dāng)P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組腸道菌群含量的比較

與對照組比較，NAFLD組雙歧桿菌、乳酸桿菌、B/E值更低(P<0.05)，腸桿菌、腸球菌更高(P<0.05)。見表1。

二、兩組血清TLR4、IL-10、IL-22水平的比較

NAFLD組血清TLR4顯著高于對照組，IL-10、IL-22低于對照組(P<0.05)。見表2。

三、NAFLD患者TLR4、IL-10、IL-22與腸道菌群的相關(guān)性分析

經(jīng)過Pearson相關(guān)性分析，NAFLD患者TLR4與雙歧桿菌、乳酸桿菌、B/E值呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與腸桿菌、腸球菌呈正相關(guān)(P<0.05)；IL-10、IL-22與雙歧桿菌、乳酸桿菌、B/E值呈正相關(guān)(P<0.05)，與腸桿菌、腸球菌呈正負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見表3。

四、 NAFLD患者腸道菌群的logistic回歸分析

以B/E值為自變量，TLR4、IL-10、IL-22為因變量，進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，TLR4、IL-10、IL-22是NAFLD患者B/E值的影響因素。結(jié)果見表4。

表1 兩組腸道菌群含量比較(lg CFU/g, ±s)

表2 兩組血清TLR4、IL-10、IL-22水平比較(±s)

表3 NAFLD患者TLR4、IL-10、IL-22與腸道菌群的相關(guān)性分析

表4 NAFLD患者腸道菌群的logistic回歸分析

討 論

有許多研究表明[5]，NAFLD的發(fā)生與腸源性內(nèi)毒素血癥有密切關(guān)系，而細(xì)菌移位、小腸細(xì)菌過度生長、腸黏膜通透性異常等均可引起腸源性內(nèi)毒素血癥。在正常人的腸道內(nèi)，各種菌群保持著動態(tài)平衡，維護(hù)著腸黏膜屏障和免疫屏障[6]。當(dāng)腸道菌群失調(diào)時(shí)，會導(dǎo)致有害菌異常增加，使腸道黏膜屏障受損，大量內(nèi)毒素進(jìn)入門靜脈，損害肝細(xì)胞，同時(shí)通過肝臟進(jìn)入血液形成內(nèi)源性內(nèi)毒素血癥，引發(fā)炎癥反應(yīng)，形成惡性循環(huán)[7]。

TLR是一類天然免疫關(guān)鍵受體。作為TLR家族一員，TLR4是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁成分LPS的受體，具有誘導(dǎo)炎癥、抗病毒、抑制細(xì)胞因子產(chǎn)生等作用。TLR4表達(dá)于各種肝細(xì)胞，當(dāng)TLR4過度表達(dá)時(shí)，可誘導(dǎo)肝臟發(fā)生免疫應(yīng)答，引起肝臟慢性炎癥反應(yīng)性疾病[8]。

IL-10是一種重要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，由Th2細(xì)胞和單核-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，其可通過抑制單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞活性，抑制肝纖維化進(jìn)程[9]。

本研究結(jié)果表明，與對照組相比，NAFLD組雙歧桿菌、乳酸桿菌、B/E值更低(P<0.05)，腸桿菌、腸球菌更高(P<0.05)。證實(shí)NAFLD患者確實(shí)存在腸道菌群失調(diào)。腸道定植能力是指內(nèi)源性厭氧菌抑制潛在致病菌在腸道內(nèi)定植的能力，因此B/E值可以全面評價(jià)腸道的菌群變化。本研究還表明，與對照組相比，NAFLD組血清TLR4更高，IL-10、IL-22更低(P<0.05)。說明NAFLD患者體內(nèi)血清TLR4、IL-10、IL-22水平異常變化。研究表明[10]，NAFLD患者由于腸道菌群失調(diào)，肝臟中內(nèi)毒素(LPS)增多，使得LPS受體TLR4表達(dá)上調(diào)，腸壁通透性增強(qiáng)，形成腸源性內(nèi)毒素血癥，引發(fā)炎癥反應(yīng)，同時(shí)還通過MyD88途徑激活核因子B，引發(fā)強(qiáng)力的炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致肝臟損傷。研究表明，隨著肝損傷程度的加重，IL-10表達(dá)逐漸降低，從而參與酒精性肝病發(fā)展過程[11]。IL-22是IL-10的同源性細(xì)胞因子，可能具有相同的保護(hù)肝臟的作用。相關(guān)研究表明[12]，經(jīng)過IL-22處理的ApoE基因敲除小鼠，血脂及肝指數(shù)均降低，能減輕小鼠肝臟的炎癥程度，提示IL-22能緩解肝臟病變進(jìn)程，抑制肝纖維化。

經(jīng)過Pearson相關(guān)性分析，NAFLD患者TLR4與雙歧桿菌、乳酸桿菌、B/E值呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與腸桿菌、腸球菌呈正相關(guān)(P<0.05)；IL-10、IL-22與雙歧桿菌、乳酸桿菌、B/E值呈正相關(guān)(P<0.05)，與腸桿菌、腸球菌呈正負(fù)相關(guān)(P<0.05)。經(jīng)logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，IL-10、IL-17、IL-23是NAFLD患者B/E值的影響因素。分析其可能原因是NAFLD患者腸道菌群紊亂，產(chǎn)生大量內(nèi)毒素，誘導(dǎo)TLR4過表達(dá)，當(dāng)TLR4過度表達(dá)時(shí)，可導(dǎo)致腸壁通透性增強(qiáng)，形成腸源性內(nèi)毒素血癥，進(jìn)而誘導(dǎo)肝臟發(fā)生免疫應(yīng)答，引起肝臟慢性炎性病變；另外，TLR4還可能通過MyD88途徑激活NFκB，進(jìn)而刺激炎性因子的釋放，抑制IL-10、IL-22的分泌，放大肝臟炎癥反應(yīng)，由此共同參與NAFLD過程。因此推測，TLR4與IL-10、IL-22可能存在上下游關(guān)系，可能是NAFLD發(fā)展過程中的一個(gè)炎癥通路，但還需進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。