邵圣枝 聶 晶 劉 志 張永志 王 鈁 Karyne M.Rogers 袁玉偉

(1浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品信息溯源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310021；2新西蘭GNS國(guó)家同位素中心,惠靈頓 下哈特5040,新西蘭)

近年來(lái),元素分析-穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜(elemental analysis-stable isotope ratio mass spectrometry,EA-IRMS)聯(lián)用技術(shù)廣泛應(yīng)用于食品安全摻假鑒別領(lǐng)域,如蜂蜜摻假鑒別[1-3]、釀造調(diào)味品真?zhèn)舞b別[1,4-5]、果汁摻假[6-8]、有機(jī)食品鑒別[9-11]、產(chǎn)地溯源[12-14]等,為產(chǎn)品品牌保護(hù)、健康飲食和消費(fèi)者權(quán)益保障提供了科學(xué)支撐。

同位素比值測(cè)定對(duì)方法精度要求高,不同樣品前處理方式可能對(duì)樣品中穩(wěn)定同位素比值測(cè)定造成影響,從而導(dǎo)致分析結(jié)果不準(zhǔn)確。生物樣品通常需在儀器分析前進(jìn)行酸化處理,消除干擾物質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。Yoder等[15]利用低濃度緩沖類(lèi)型的酸和未含緩沖類(lèi)型的酸對(duì)骨磷石碳進(jìn)行預(yù)處理,結(jié)果表明2種酸處理未對(duì) δ13C和 δ18O測(cè)定造成顯著差異。Turner Tonaszewicz等[16]對(duì)海洋動(dòng)物中不同新鮮程度的皮質(zhì)骨進(jìn)行酸化處理,雖然δ13C和δ15N有一定程度的變化(＜1‰),但可通過(guò)建立方程對(duì)測(cè)定值進(jìn)行校正。Connolly等[17]以海草和以海草為食的海洋動(dòng)物為研究對(duì)象,發(fā)現(xiàn)酸化處理對(duì)δ34S影響較大,平均降低了2.6‰,有的單個(gè)樣品偏差甚至達(dá)到7.0‰。除此之外,脫脂[18]、干燥[19]等方法也可能會(huì)對(duì)動(dòng)物樣品中同位素產(chǎn)生影響。Vizza等[20]對(duì)比了保存在乙醇中不同時(shí)間段的魚(yú)鰭樣品中δ13C、δ15N以及C∶N的變化情況,結(jié)果顯示δ13C變大,而δ15N保持不變,在極大程度上與碳氮含量相關(guān)。對(duì)于大部分植物樣品,脂肪和蛋白質(zhì)含量極低,前處理中無(wú)需進(jìn)行酸化處理,直接對(duì)植物樣品進(jìn)行真空冷凍干燥后保存。王周鋒等[21]分別對(duì)4種不同植物樣品經(jīng)過(guò)殺青干燥和直接干燥處理后δ15N的變化進(jìn)行對(duì)比,結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種方式對(duì)δ15N均無(wú)影響。我國(guó)茶葉生產(chǎn)地域廣泛、種類(lèi)繁多,主要有黑茶、紅茶、白茶、綠茶、黃茶和烏龍茶,其中綠茶為非發(fā)酵茶,紅茶屬于全發(fā)酵茶,都要經(jīng)過(guò)不同工藝加工而成。在茶葉產(chǎn)地溯源中應(yīng)用穩(wěn)定同位素檢測(cè)已有較多文獻(xiàn)報(bào)道[22-24],穩(wěn)定同位素δ13C、δ18O、δ15N 和 δ2H 已成為重要的地理標(biāo)識(shí)特征指標(biāo)。與其他生物樣本相比,茶葉加工和樣品制備較為簡(jiǎn)單。劉志等[13]對(duì)比了5種烘干方式對(duì)茶葉中 δ13C、δ18O、δ15N和 δ2H 的影響,結(jié)果顯示不同干燥方式對(duì)4種同位素比值并不會(huì)產(chǎn)生較大影響。然而,國(guó)內(nèi)外鮮有相同原料加工的綠茶和紅茶是否發(fā)生同位素分餾,不同目數(shù)制備樣品是否影響同位素比值測(cè)定的報(bào)道。

本研究首先建立EA-IRMS測(cè)試方法,探討相同鮮茶葉所加工的綠茶和紅茶是否發(fā)生同位素分餾現(xiàn)象,并考察不同目數(shù)的樣品對(duì)同位素測(cè)定的影響,以期為茶葉產(chǎn)地溯源同位素?cái)?shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建和樣品制備方法的規(guī)范化提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

采集同一批嶗山綠茶鮮葉(一芽一葉或一芽?jī)扇~)(2015年),分別按照綠茶(非發(fā)酵茶)和紅茶(全發(fā)酵茶)加工工藝制備,由山東省嶗山海瀛茶廠加工制備。

氫氧化鈉、五氧化二磷購(gòu)自德國(guó)Millipore公司；穩(wěn)定同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)IAEA-CH-6(蔗糖,δ13CV-PDB=-10.449‰±0.033‰)、IAEA-600(咖啡因,δ13CV-PDB=-27.771‰±0.043‰,δ15Nair=1.0‰±0.2‰)、IAEAN-2(硫酸銨,δ15Nair=20.3‰±0.2‰)、IAEA-601(苯甲酸,δ18OV-SMOW=23.14‰±0.19‰)、IAEA-602(苯甲酸,δ18OV-SMOW=73.35‰±0.39‰)、IAEA-CH-7(聚乙烯,δ2HV-SMOW=-100.3‰±2.0‰),均購(gòu)自國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)(IAEA,奧地利)；B2203(δ2HV-SMOW=-25.30‰ ± 5.10‰)、B2155(δ15Nair=5.94‰ ±0.08‰)、B2174(δ13CV-PDB=-37.421‰±0.017‰),購(gòu)自英國(guó)Elemental Microanalysis公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Vario PYRO cube元素分析儀,德國(guó)Elementar公司；Isoprime 100型同位素質(zhì)譜儀,英國(guó)Isoprime公司；FW100型粉碎機(jī),天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 樣本制備

茶葉樣品用高速粉碎機(jī)循環(huán)研磨5次,每次時(shí)長(zhǎng)30 s,間隔10 s,形成粉末狀,然后制備分別經(jīng)80目(孔徑 0.180 mm)、100目(孔徑 0.150 mm)、120目(孔徑0.125 mm)孔篩和未過(guò)篩4種樣本。紅茶和綠茶樣品各10個(gè)樣本,同種茶葉不同目數(shù)樣品數(shù)量為40個(gè),共計(jì)80個(gè),常溫避光保存。

1.4 同位素比率值測(cè)定

1.4.113C和15N同位素比值測(cè)定 稱(chēng)取1.5～2.5 mg茶葉樣品包樣于錫杯；元素分析儀主要參數(shù):燃燒管溫度920℃,還原管中溫度600℃,TCD溫度60℃,氦氣吹掃流量250 mL·min-1,氧氣流量 40 mL·min-1；參考?xì)怏w儀主要參數(shù):氦氣壓力2 psi,參考?xì)舛趸己偷獨(dú)獾膲毫Ψ謩e為12 psi和5 psi；質(zhì)譜主要參數(shù):離子源加速電壓3.97 kV,磁電流3 500 mA。茶葉中含碳量較含氮量偏高,同時(shí)測(cè)定過(guò)程中,儀器方法中設(shè)置二氧化碳?xì)怏w稀釋步驟。

1.4.22H和18O同位素比值測(cè)定 稱(chēng)取0.95～1.05 mg茶葉樣品包樣于銀杯；元素分析儀主要參數(shù):裂解管溫度 1 450℃,TCD溫度 60℃；氦氣流量 300 mL·min-1；參考?xì)怏w儀主要參數(shù):氦氣壓力1.5 psi,參考?xì)鈿錃夂鸵谎趸嫉膲毫Ψ謩e為18 psi和5 psi；質(zhì)譜主要參數(shù):離子源加速電壓4.23 kV,磁電流為2 200 mA。茶葉中含氫量較含氧量偏低,同時(shí)測(cè)定過(guò)程中,儀器方法中設(shè)置一氧化碳?xì)怏w稀釋步驟。

1.4.3 穩(wěn)定同位素比率值計(jì)算 由于元素重同位素自然豐度相對(duì)較低,國(guó)際上通常采用將已知同位素比率的標(biāo)準(zhǔn)品作為參照,計(jì)算樣本中穩(wěn)定同位素比率的相對(duì)值。穩(wěn)定性同位素比率計(jì)算公式為:

式中,R樣品為所測(cè)樣品中重同位素與輕同位素豐度比,即13C/12C、15N/14N、18O/16O、2H/1H；R標(biāo)準(zhǔn)為標(biāo)準(zhǔn)樣品中重同位素與輕同位素豐度比。

測(cè)定樣品時(shí),δ13C和δ15N采用三點(diǎn)校正法,δ2H和δ18O采用兩點(diǎn)校正法對(duì)結(jié)果進(jìn)行定值,且在測(cè)定過(guò)程中每間隔16個(gè)樣品需測(cè)定同位素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為樣品測(cè)定過(guò)程中穩(wěn)定性指標(biāo),穩(wěn)定性要求經(jīng)校正后的比值的標(biāo)準(zhǔn)偏差在證書(shū)標(biāo)定范圍內(nèi)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,SPSS 18.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定方法準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性驗(yàn)證

在樣品測(cè)定前,首先進(jìn)行參考?xì)怏w穩(wěn)定性和線性測(cè)試,然后再進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性和線性測(cè)試,最后以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的測(cè)定結(jié)果為基礎(chǔ),保證測(cè)試樣品在規(guī)定的響應(yīng)強(qiáng)度范圍內(nèi)。以?xún)x器信號(hào)5 nA左右作為參考?xì)夂蜆?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性的固定響應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。

參考?xì)怏w穩(wěn)定性和線性:各參考?xì)怏w的線性測(cè)試范圍均為:CO2的標(biāo)準(zhǔn)偏差 0.02‰、CO2的線性0.03‰·nA-1；N2的標(biāo)準(zhǔn)偏差 0.04‰、N2的線性0.03‰·nA-1；CO 的標(biāo)準(zhǔn)偏差 0.03‰,CO 的線性0.02‰·nA-1；H2的標(biāo)準(zhǔn)偏差 0.12‰,H3+校正因子為7.2。以上氣體穩(wěn)定性和線性均符合儀器限定標(biāo)準(zhǔn)。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性:分別稱(chēng)取各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相近質(zhì)量多份(n=10)進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如表1所示,標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)限定的范圍要求,方法可行。

表1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性和線性測(cè)定結(jié)果Table 1 Stability and linearity results of standard substance

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)線性:分別稱(chēng)取各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)差異質(zhì)量多份(n=3或5)；CO2(44m/z)響應(yīng)強(qiáng)度在3～7 nA下,3種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的δ13C較為穩(wěn)定,稱(chēng)量質(zhì)量對(duì)該定值影響較??；N2(28m/z)響應(yīng)強(qiáng)度在2～9 nA下,2種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的δ15N值較為穩(wěn)定,稱(chēng)量質(zhì)量對(duì)結(jié)果影響也較??；CO(28m/z)和H2(2m/z)響應(yīng)強(qiáng)度在2～10 nA下,各標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的δ變化相對(duì)較大,為使測(cè)定結(jié)果更準(zhǔn)確,規(guī)定在測(cè)定過(guò)程中稱(chēng)取相近質(zhì)量的樣品保證其響應(yīng)強(qiáng)度為5 nA左右。

校準(zhǔn)曲線:δ13C和δ15N分別采用3種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)構(gòu)建校準(zhǔn)曲線,其校準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.999；δ2H和δ18O分別采用2種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)構(gòu)建校準(zhǔn)曲線,其校準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.999。

長(zhǎng)期穩(wěn)定性:在測(cè)試期間,多次更換氣瓶、填充原料,在以上儀器參數(shù)條件下,測(cè)定結(jié)果均保持穩(wěn)定。

2.2 加工工藝對(duì)茶葉中穩(wěn)定同位素比率值影響

紅茶與綠茶樣品分別經(jīng)過(guò)不同的加工工藝制成,即紅茶(全發(fā)酵)經(jīng)過(guò)萎凋-揉捻-發(fā)酵-干燥等步驟,而綠茶(非發(fā)酵)經(jīng)過(guò)攤青-殺青-揉捻-制形-干燥等步驟。為考察2種加工工藝對(duì)茶葉中同位素分餾的可能影響,將紅茶與綠茶樣品經(jīng)過(guò)粉碎后,過(guò)相同目數(shù)篩后進(jìn)行測(cè)定,紅茶 δ13C值變化范圍在-28.1‰～27.7‰之間、δ15N 范圍在 3.7‰～4.1‰、δ2H 范圍在-66.1‰～-54.6‰、δ18O 范圍在 18.5‰～22.9‰；綠茶δ13C值變化范圍在-28.2‰～-27.7‰之間、δ15N范圍在 3.9‰～4.5‰、δ2H 范圍在-67.1‰～-50.6‰、δ18O范圍在20.0‰～22.7‰,結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明,紅茶和綠茶中4種穩(wěn)定同位素比率的均值雖有不同,但差別不大,均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差均接近,兩者間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。由此可知,在加工過(guò)程中,茶葉中單體成分或某些組分可能會(huì)發(fā)生同位素比值的分餾變化,但并未發(fā)生質(zhì)量的損失,根據(jù)同位素質(zhì)量平衡原理,其總體的同位素比值將保持不變。

2.3 單因素方差分析過(guò)篩目數(shù)對(duì)紅茶與綠茶中穩(wěn)定同位素比率值影響

將紅茶和綠茶樣本粉碎后,設(shè)置未過(guò)篩和分別過(guò)80目、100 目、120 目篩處理,測(cè)定 δ13C、δ15N、δ2H、δ18O等4種同位素比值,單因素方差分析比較4種不同目數(shù)茶葉樣本的差異性,結(jié)果見(jiàn)表2和表3。4種穩(wěn)定同位素比值的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差均相近,紅茶δ13C值變化范圍在-28.0‰～-27.6‰之間、δ15N范圍在3.5‰～4.4‰、δ2H 范圍在-67.1‰～ -52.6‰、δ18O 范圍在 19.5‰～23.0‰；綠茶中 δ13C值變化范圍在-28.1‰～-27.7‰ 之間、δ15N 范圍在 3.9‰～4.4‰、δ2H范圍在-60.1‰～-55.6‰、δ18O范圍在19.3‰～22.7‰。通過(guò)單因素方差分析,植物樣品制備過(guò)程中過(guò)篩目數(shù)對(duì)紅茶和綠茶4種同位素比值均無(wú)顯著影響(P＞0.05),也說(shuō)明樣品在粉碎過(guò)程中具有均一性,不同目數(shù)過(guò)篩對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)影響。

表2 紅茶樣本經(jīng)不同目數(shù)過(guò)篩對(duì)不同穩(wěn)定同位素的測(cè)定影響Table 2 Effects of mesh screening on the determination of different stable isotopes in black tea /‰

表3 綠茶樣本經(jīng)不同目數(shù)過(guò)篩對(duì)不同穩(wěn)定同位素的測(cè)定影響Table 3 Effects of mesh screening on the determination of different stable isotopes in green tea /‰

圖1 紅茶與綠茶中穩(wěn)定同位素值比較Fig.1 Comparison of stable isotope value between black tea and green tea

3 討論

在分析測(cè)試體系建立研究中,首先參考?xì)怏w的穩(wěn)定性和線性良好,這是下一步測(cè)試樣品的基礎(chǔ)；以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為參照,δ13C與δ15N檢測(cè)結(jié)果受儀器響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)弱的影響較小,因此樣品質(zhì)量對(duì)定值影響較??；而δ2H與δ18O檢測(cè)結(jié)果受儀器響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)弱的影響較大。因此,為保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,需按照一定質(zhì)量進(jìn)行稱(chēng)量,滿足穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性要求。在實(shí)際樣品測(cè)定過(guò)程中,通過(guò)兩點(diǎn)法或三點(diǎn)法構(gòu)建的校準(zhǔn)曲線具有很好的相關(guān)性,能夠滿足測(cè)試精度要求。此外,固體δ2H測(cè)量還存在交換氫的現(xiàn)象,利用相同基質(zhì)或相同交換氫百分比的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行校正所得的結(jié)果更加準(zhǔn)確和穩(wěn)定[25]。

由于同位素之間在物理、化學(xué)性質(zhì)上的差異,在物理、化學(xué)及生物化學(xué)作用過(guò)程中一種元素的不同同位素在兩種或兩種以上物質(zhì)(物相)之間的分配具有不同的同位素比值現(xiàn)象,稱(chēng)為同位素分餾。綠茶加工過(guò)程中,攤青僅使葉片中的水蒸發(fā),殺青步驟使得葉片中的酶失活；而紅茶的加工過(guò)程中,萎凋使得葉片中酶活性增強(qiáng),揉捻步驟增加了茶多酚與酶接觸面積,是下一步發(fā)酵過(guò)程的關(guān)鍵步驟。2個(gè)不同的加工過(guò)程,不同的酶活性使得葉片中的物質(zhì)發(fā)生了生物化學(xué)變化。根據(jù)質(zhì)量守恒定律[26],針對(duì)同一種元素:δXbulk=(δC1·C1+δC2·C2+δC3·C3+……+δCn·Cn)/(C1+C2+C3+……+Cn),其中δCn代表不同化合物的同位素比值,Cn代表不同化合物的百分含量；從該式可知,即使不同的加工過(guò)程,單體化合物的同位素發(fā)生分餾并不影響總體同位素比值。植物中碳同位素比率主要與植物的光合作用途徑[C3、C4和景天酸代謝(crassulacean acid metabolism pathway,CAM)途徑]有關(guān),由于C3植物和C4植物各自獨(dú)特的碳循環(huán)系統(tǒng),其對(duì)CO2的吸收能力各不相同。C3植物的δ13C值變化在-22‰～-34‰之間,C4植物的δ13C值變化在-9‰～-19‰之間,茶樹(shù)屬于C3植物,測(cè)定的δ13C范圍在-28.0‰～-27.7‰之間,均處在C3植物范圍內(nèi)。δ15N主要與施肥活動(dòng)密切相關(guān),袁玉偉等[27-28]指出配施不同比例的有機(jī)肥-化肥會(huì)影響大白菜與黃瓜葉片中δ15N,并且可以通過(guò)該值判定植物在生長(zhǎng)過(guò)程中是否使用化肥。馮海強(qiáng)等[29]認(rèn)為如茶葉中δ15N在7以下,則大多使用化肥氮肥。結(jié)合本研究結(jié)果認(rèn)為,該批茶葉使用化肥的可能性較大,這與實(shí)際情況也較為符合。植物組織中δ2H、δ18O與其產(chǎn)地環(huán)境的經(jīng)緯度、海拔、降水、氣溫等密切相關(guān),能直接反映其生長(zhǎng)的地域信息[12,30]。

經(jīng)測(cè)定分析,相同新鮮茶葉原料經(jīng)過(guò)不同加工工藝對(duì)同位素比值影響較小,即紅茶與綠茶中4個(gè)同位素比值均基本保持不變,整體上無(wú)明顯分餾現(xiàn)象,對(duì)產(chǎn)地溯源數(shù)據(jù)庫(kù)建立提供理論依據(jù)；此外,在植物樣品前處理過(guò)程中,過(guò)篩目數(shù)對(duì)同位素比值影響較小,說(shuō)明在粉碎過(guò)程中樣品具有充分均一性,對(duì)樣品中總體值測(cè)定幾乎無(wú)影響。

4 結(jié)論

基于 EA-IRMS 所建立的 δ13C、δ15N、δ2H、δ18O 4種同位素測(cè)試方法,通過(guò)兩點(diǎn)法或三點(diǎn)法構(gòu)建的校準(zhǔn)曲線具有很好的相關(guān)性,能滿足測(cè)試精度要求。同一產(chǎn)區(qū)相同新鮮茶葉原料經(jīng)過(guò)不同工藝過(guò)程制成的紅茶和綠茶樣品,4種穩(wěn)定同位素比值均無(wú)顯著差異(P＞0.05)；在植物樣品制備中,過(guò)篩目數(shù)對(duì)紅茶和綠茶種穩(wěn)定同位素比值也無(wú)顯著差異(P＞0.05)。因此,不同加工工藝(全發(fā)酵和非發(fā)酵)對(duì)茶葉中 δ13C、δ15N、δ2H、δ18O同位素比值基本無(wú)影響,整體上未發(fā)生分餾現(xiàn)象；不同目數(shù)制備對(duì)4種穩(wěn)定同位素組成也均無(wú)影響,說(shuō)明在粉碎過(guò)程中樣品已具有良好的均一性,不同實(shí)驗(yàn)室的樣品制備能夠滿足檢測(cè)要求。本研究結(jié)果可為不同類(lèi)型茶葉同位素?cái)?shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建和樣品制備提供測(cè)試方法基礎(chǔ)和理論依據(jù)。