中國(guó)水牛乳蛋白基因型與酪蛋白膠束粒度的關(guān)聯(lián)研究

陳 晨，趙烜影，郭 鸰，李 玲，劉建新，任大喜*

（1.浙江大學(xué)奶業(yè)科學(xué)研究所，浙江杭州 310058；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；3.廣西水牛研究所，廣西南寧 530001）

中國(guó)養(yǎng)殖水牛超過(guò)1 200 萬(wàn)頭，水牛乳產(chǎn)量居世界第三。與荷斯坦牛乳相比，水牛乳營(yíng)養(yǎng)豐富，能夠?yàn)槿祟?lèi)營(yíng)養(yǎng)發(fā)揮重要作用，但長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)對(duì)乳品的基礎(chǔ)研究不足，對(duì)水牛乳、羊乳和駱駝乳等新興乳品研究更加匱乏。酪蛋白是乳品中的主要蛋白成分，也是食品加工中最主要的原料成分之一，研究酪蛋白亞型結(jié)構(gòu)對(duì)提升水牛乳品質(zhì)起到重要作用。

自1955 年，Aschaffenburg 等[1]等第1 次揭示β-乳球蛋白（β-LG）的多態(tài)性以來(lái)，相繼發(fā)現(xiàn)了αs1-酪蛋白（αs1-CN）、β-酪蛋白（β-CN）、κ-酪蛋白（κ-CN）的多態(tài)性。乳蛋白基因多態(tài)性與牛乳成分、泌乳性能以及乳制品加工特性等密切相關(guān)，因此國(guó)內(nèi)外研究者開(kāi)展了大量研究。前期研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)荷斯坦奶牛的κ-CN、β-CN 和β-LG 均存在多態(tài)性，且這些乳蛋白基因多態(tài)性與泌乳性能存在顯著關(guān)聯(lián)[2]。此外，還發(fā)現(xiàn)干酪凝乳性能和終產(chǎn)品品質(zhì)與κ-CN 的B 基因存在正相關(guān)，與E基因存在負(fù)相關(guān)[3]。

在牛奶中，酪蛋白多以分散的、大致呈球形的膠體顆粒形式存在，被稱(chēng)為“酪蛋白膠束”，大小在150～230 nm 變化[4-6]。部分學(xué)者認(rèn)為酪蛋白膠束大小的變化似乎與奶牛的年齡、產(chǎn)奶量、泌乳階段或奶中的脂肪或蛋白質(zhì)含量不相關(guān)[6]，但酪蛋白膠束與干酪加工過(guò)程中的凝乳強(qiáng)度、干酪的硬度等性質(zhì)密切相關(guān)[7]。關(guān)于膠束的精細(xì)結(jié)構(gòu)及其如何受到酪蛋白遺傳變異體的影響，目前仍沒(méi)有明確共識(shí)[8-9]。酪蛋白組成與粒徑之間是否存在相關(guān)性尚存爭(zhēng)議，原因之一在于不同作者在酪蛋白膠束的制備和成分分析方面有差異，以及不同作者對(duì)膠束尺寸“大”和“小”的定義并不一致[10]。大多數(shù)對(duì)于酪蛋白膠束功能性遺傳學(xué)的研究都集中在κ-CN變體、蛋白質(zhì)粒度和牛奶功能特性之間的關(guān)系上[6]。即使有研究發(fā)現(xiàn)β-CN 的A2A2基因型與不良凝固性質(zhì)相關(guān)，關(guān)于β-CN 亞型與蛋白質(zhì)粒度的關(guān)聯(lián)研究仍是較少的[11-13]。本研究擬采用反相高效液相色譜法來(lái)分析水牛乳中主要蛋白的多態(tài)性，并建立酪蛋白各亞型和酪蛋白膠束粒度的關(guān)聯(lián)，以期為我國(guó)水牛品種改良和水牛乳質(zhì)量的遺傳選擇提供新的見(jiàn)解，并促進(jìn)加工技術(shù)轉(zhuǎn)型升級(jí)以提高加工效率和乳制品質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集 水牛乳樣采自廣西水牛研究所牧場(chǎng)。2017 年3 月選取160 頭泌乳中期的中國(guó)水牛，每頭采集50 mL 新鮮乳樣，4 000 ×g 離心15 min 除去乳脂肪，各取500 μL 分裝于離心管中用于分析多態(tài)性，-20℃凍存?zhèn)溆?，其余樣品馬上進(jìn)行粒度分析。

1.1.2 試劑 乙腈、三氟乙酸（TFA）、甲醇均為色譜純?cè)噭?，Bis-Tris、鹽酸胍、二硫蘇糖醇（DTT）、檸檬酸鈉均為分析純?cè)噭?。?shí)驗(yàn)所用水均為Millpore 超純水。αs-CN、β-CN、κ-CN、α-LA 和β-LG 標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自sigma 公司。

1.1.3 儀器 安捷倫1260 型液相色譜（Agilent Technologies Inc 1260-LC）、離心機(jī)（上海滬湘儀 TW16-WS）、超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司 KQ-250DE）、渦旋混合器（上海精科實(shí)驗(yàn)有限公司 XW-80A）、超純水儀（Millpore Direct-Q8 UV），Bettersize 2000 型激光粒度分析儀（丹東百特儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多態(tài)性分析 向分裝的冷凍乳樣中加入等體積的工作液Ⅰ（0.1 mol/L BisTris，6 mol/L 鹽酸胍，5.37 mmol/L檸檬酸鈉，19.5 mmol/L DTT 的混合溶液），樣品融化后振蕩10 s 混勻，室溫靜置1 h。將混合溶液16 000 ×g 4℃離心5 min，除去表層乳脂，取底層溶液300 μL 于新的離心管中，加入工作液Ⅱ（以流動(dòng)相A 為溶劑的4.5 mol/L鹽酸胍溶液）稀釋?zhuān)w積比1:3），混勻，過(guò)濾到進(jìn)樣瓶中待測(cè)。

采用安捷倫1260 型液相色譜儀，色譜柱為C8 柱（300SB-C8），流動(dòng)相A 為0.1% TFA 水溶液，流動(dòng)相B 為0.1% TFA 乙腈溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm，柱溫45℃，進(jìn)樣量10 μL，流速0.5 mL/min。乳蛋白分析的梯度洗脫程序參照劉亞楠等實(shí)驗(yàn)方法[14]。

1.2.2 粒度測(cè)定 取40 mL 乳樣1 500 ×g 15 min 4℃反復(fù)離心2 次，除去乳脂。通過(guò)Bettersize 2000 型激光粒度分析儀測(cè)定其粒度數(shù)據(jù)體積動(dòng)量平均值（D[4,3]），面積動(dòng)量平均值（D[3,2]）和中位徑（D[50]）。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間，判定樣品各個(gè)乳蛋白的出峰順序。依據(jù)Bonfatti 等[15]液相出峰時(shí)間判定實(shí)驗(yàn)中乳蛋白多態(tài)性。收集各乳樣的粒度數(shù)據(jù)采用SAS（9.2）軟件的MIXED 程序?qū)?shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析。利用最小二乘法擬合線性模型，比較不同復(fù)合基因型牛乳的酪蛋白膠束粒度的差異。由于水牛場(chǎng)系譜數(shù)據(jù)不夠全面，模型中不考慮水牛個(gè)體之間的親緣關(guān)系，所有環(huán)境因素也因此剔除，使得基因效應(yīng)不被環(huán)境變異所掩蓋。所用模型：

式中，Y 為酪蛋白粒度；μ 為群體均值系數(shù)；Gi為復(fù)合基因型固定效應(yīng)；H 為牛群固定效應(yīng)；Pm為胎次固定效應(yīng)；eijk為隨機(jī)殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳蛋白多態(tài)性分析 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間，可以獲得不同乳蛋白的出峰順序。如圖1-A 所示，6 種乳蛋白的出峰順序?yàn)椋害?CN、αs2-CN、αs1-CN、β-CN、α-LA和β-LG[2]。αs1-CN 存在A、B 2 個(gè)等位基因，有AA、AB 和BB 3 種基因型，β-CN 存在A 型和B 型2 種多態(tài)性，κ-CN 有A 型、B 型、C 型和D 型4 種多態(tài)性。α-LA 存在A 型和B 型2 種多態(tài)性，αs2-CN 和β-LG 沒(méi)有發(fā)現(xiàn)多態(tài)性。

2.2 乳蛋白多基因頻率分析 水牛乳蛋白等位基因頻率與各亞型統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。其中αs1-CN 的2 種等位基因中B 的比例明顯大于A，為81.56%，3 種基因型的頻率中BB 最大，占66.87%。在β-CN 中，B 等位基因頻率遠(yuǎn)高于A，3 種基因型的頻率BB 最高，為64.38%。κ-CN 的4 種等位基因中，B 也是最高，為84.40%。α-LA 同樣存在A 和B 2 種等位基因，B 頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于A，占90.62%，BB 也高于AA。αs2-CN 和β-LG只存在BB 基因型。

本研究中，αs2-CN 和β-LG 不存在基因多態(tài)性，共得到7 種αs1-β-κ-CN 酪蛋白復(fù)合基因型。其中，AA-BB-BB 復(fù)合基因型個(gè)數(shù)最多，為46 個(gè)。AB-BBAB 和AA-AA-BB 復(fù)合基因型個(gè)數(shù)最少，僅為4 個(gè)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 水牛乳蛋白等位基因頻率與基因型統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表2 αs1-β-κ-CN 復(fù)合基因型

2.3 水牛乳酪蛋白粒度分析 本研究通過(guò)激光粒度儀分析水牛乳樣品的蛋白粒度（D），結(jié)果如圖2 所示，蛋白的表面積平均徑D[3，2]分布于0.200～0.279 μm，主要集中在0.220～0.239 μm，約占蛋白總量的56%。蛋白的體積平均徑D[4，3]分布于0.220～0.900 μm，其中0.240～0.249 μm 與0.250～0.259 μm 2 種不同 體積平均徑的組分比例最高，分別占蛋白總量的20% 和22%。蛋白的中位粒徑D50 主要集中在0.240～0.259 μm，約占蛋白總量的59%。

2.4 水牛乳酪蛋白與蛋白粒度的關(guān)聯(lián) 利用SAS9.2 軟件統(tǒng)計(jì)分析各酪蛋白與蛋白粒度的關(guān)聯(lián)，結(jié)果如表3所示，κ-CN 的BB、AB 和BC 3 種基因型在D[3，2]上差異顯著，并且AB 與BC 組內(nèi)差異顯著；κ-CN 的BB、AB 和BC 3 種基因型在D50 上差異顯著，AB 與BC、BB 與BC 組內(nèi)差異顯著。通過(guò)D50 可以看出：擁有κ-CN 的C 等位基因的樣品蛋白的中位粒徑＜擁有B等位基因的樣品＜擁有A 等位基因的樣品。

αs1-CN 的AA、AB 和BB 3 種基因型在D[3，2]上有顯著差異，并且AB 與BB 組內(nèi)差異顯著。β-CN的3 種基因型在蛋白粒度的3 項(xiàng)指標(biāo)中差異不顯著。

表3 水牛乳蛋白基因多態(tài)性與酪蛋白膠束粒度（μm）的關(guān)系

水牛的αs2-CN、β-LG 和α-LA 基本上不存在多態(tài)性或者樣本數(shù)很少。水牛多態(tài)性主要在αs1-CN、β-CN、κ-CN 這3 種蛋白上，而這3 種蛋白是牛乳中的主要酪蛋白，對(duì)乳品加工影響顯著，因此選取αs1-β-κ-CN 復(fù)合基因型進(jìn)行研究。通過(guò)SAS9.2 軟件統(tǒng)計(jì)分析6 種復(fù)合基因型乳蛋白粒度與基因型的關(guān)聯(lián)，結(jié)果如表4 所示，這6 種復(fù)合基因型在D[3，2]和D50 上有顯著差異。αs1-β-κ-CN 復(fù)合基因型中的AA-BB-AB 的D[3，2]和D50 分別為0.241 μm 和0.257 μm，均為6 種復(fù)合基因型的最大值，而AB-BB-AB 的D[3，2]和D50 分別為0.216 μm 和0.234 μm，均為6 種復(fù)合基因型的最小值，可以推斷在復(fù)合基因型中αs1-CN 為AA 型的蛋白粒度大于AB 型。

表4 水牛乳蛋白復(fù)合基因型多態(tài)性與酪蛋白膠束粒度（μm）的關(guān)系

3 討 論

3.1 水牛乳酪蛋白多態(tài)性分析 目前測(cè)定乳蛋白多態(tài)性的方法包括分子水平和蛋白水平兩大類(lèi)，其中高效液相色譜法是一種快速準(zhǔn)確的測(cè)定方法。本研究發(fā)現(xiàn)αs1-CN 存在A 和B 2 種基因型，與王強(qiáng)等[16]、Maria[17]的研究結(jié)果一致。本研究中αs2-CN 全部為BB 型，與其他報(bào)道相同[18]。任大喜等[19]通過(guò)焦磷酸測(cè)序和液相色譜結(jié)合分析發(fā)現(xiàn)我國(guó)水牛的β-CN 存在A、B 和C 3 種等位基因。本研究發(fā)現(xiàn)κ-CN 的多態(tài)性較為豐富，有A、B、C、D 4 種等位基因，這與Pipalia 等[20]、Dayem等[21]分別用印度水牛與埃及水牛僅發(fā)現(xiàn)B 型的研究結(jié)果不同，本研究出現(xiàn)兩例BD 型，其中的D 基因型此前并未在水牛中被發(fā)現(xiàn)過(guò)，可進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究發(fā)現(xiàn)α-LA 有A 和B 2 種基因型，不同于Dayal 等[22]在Bhadwari、Mehsana、Surti 和Murrah 4 種水牛中發(fā)現(xiàn)的A、B、C、D 和E 5 種基因型；而β-LG 僅有B 型等位基因，這與Vohra 等[23]研究發(fā)現(xiàn)有A、B、C 3 個(gè)不同基因型的報(bào)道不一致。原因一方面可能在于奶牛品種不同，因?yàn)槿榈鞍捉M成不僅受基因型影響，還與奶牛體況、環(huán)境、飼養(yǎng)管理方法等因素有關(guān)，另一方面是本研究樣本數(shù)量有限，所檢測(cè)到的牛乳蛋白基因型相對(duì)較少。

3.2 水牛乳酪蛋白亞型與蛋白粒度的關(guān)聯(lián) 本研究通過(guò)激光粒度儀分析廣西水牛乳樣品，測(cè)得蛋白粒徑的分布范圍與李子超等[24]通過(guò)納米粒度分析儀和掃描電子顯微鏡研究發(fā)現(xiàn)水牛乳酪蛋白直徑大小分布于43.8～825.0 nm的結(jié)果相近，但本研究中蛋白粒度與他們研究中酪蛋白粒度以458.7～531.2 nm 為主有差異。這可能與兩地引進(jìn)的水牛品種不同以及所處不同的泌乳階段等因素有關(guān)。

本研究通過(guò)分析不同酪蛋白亞型與蛋白粒度的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)κ-CN 的AB、BB 及BC 3 種亞型在D[3，2]和D50 上有顯著差異，等位基因?yàn)锳 的樣品蛋白粒度＜含B 的樣品＜含C 的樣品。這與Day 等[10]研究荷斯坦牛乳發(fā)現(xiàn)的大酪蛋白膠束樣品中只含有κ-CN 的AA 亞型，而在小酪蛋白膠束的乳樣中發(fā)現(xiàn)了κ-CN 的AA、AB 和BB 亞型結(jié)果相似。而B(niǎo)ijl 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，與AB 和BB 亞型相比，κ-CN 的BE 亞型與大的酪蛋白膠束相關(guān)，與本研究結(jié)果略有差異，可能是因?yàn)榕５钠贩N不同。Pirisi 等[25]發(fā)現(xiàn)綿羊乳中含有αs1-CN 的蛋白膠束，平均粒徑為DD 型＜ DC 型＜ CC 型，且三者之間有極顯著差異，這與本研究發(fā)現(xiàn)αs1-CN 的AA、AB和BB 3 種亞型在D[3，2]上有顯著差異的結(jié)果一致。本研究中水牛乳αs1-CN 的樣品蛋白粒徑AA 型＜ AB型＜BB 型。Ketto 等[26]研究發(fā)現(xiàn)挪威紅牛擁有αs1-CN的BC 亞型的蛋白膠束粒徑小于BB 亞型，β-CN 的基因多態(tài)性對(duì)蛋白膠束粒徑?jīng)]有影響，這與本研究發(fā)現(xiàn)β-CN 各亞型在蛋白粒度上沒(méi)有明顯差異的結(jié)果一致。Day 等[5]研究荷斯坦牛乳發(fā)現(xiàn)的大蛋白膠束乳樣只含有A1A1、A1A2和A2A23 種β-CN 亞型，而在小膠束乳樣品中鑒定出包括B 和I 的遺傳變體在內(nèi)的相當(dāng)多的表型混合物。Lodes 等[27]發(fā)現(xiàn)與含有A1A1基因型的牛奶相比，含有BB 基因型的β-CN 的牛奶具有更小的膠束尺寸，但在A2A2的情況下則不然，這與本研究結(jié)果不一致，可能是因?yàn)樗５摩?CN 亞型遠(yuǎn)少于荷斯坦牛的β-CN 亞型。

3.3 水牛乳復(fù)合基因型與蛋白粒度的關(guān)聯(lián) 本研究發(fā)現(xiàn)這6 種復(fù)合基因型在D[3，2]和D50 上有顯著差異。αs1-β-κ-CN 復(fù) 合 基 因 型 中 的AA-BB-AB 的D[3，2]和D50 均為6 種復(fù)合基因型的最大值，AB-BB-AB 的D[3，2]和D50 均為6 種復(fù)合基因型的最小值，并且AA-BB-AB 同AA-AB-BC 以及AB-BB-AB 組間差異顯著。這與Ketto 等[26]研究挪威紅牛發(fā)現(xiàn)αs1-β-κ-CN 復(fù)合基因型對(duì)酪蛋白膠束大小有極顯著影響的結(jié)果一致，他們?cè)贐B-A1A2-BE 復(fù)合基因型中發(fā)現(xiàn)較大的蛋白膠束粒徑。Gustavsson 等[28]研究發(fā)現(xiàn)β-κ-CN 的A1A2-AB復(fù)合基因型中的酪蛋白膠束粒徑小于A2A2-AA 和A1A1-EE 復(fù)合基因型。這些研究都表明酪蛋白復(fù)合基因型對(duì)酪蛋白膠束大小有顯著影響。

目前，國(guó)內(nèi)外尚未有關(guān)于水牛乳蛋白多態(tài)性與膠束粒度關(guān)聯(lián)的報(bào)道，前人研究表明酪蛋白膠束與干酪加工等密切相關(guān)。水牛乳是加工馬蘇里拉等干酪的優(yōu)質(zhì)原料，因此本研究結(jié)果可為特定水牛品種的選育提供指導(dǎo)，為今后水牛乳的深加工提供支持。

4 結(jié) 論

本研究采用反向高效液相色譜法分析了我國(guó)南方地區(qū)水牛乳蛋白多態(tài)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水牛的κ-CN、β-CN、αs1-CN 和α-LA 都 存在 多 態(tài)性，而αs2-CN 和β-LG 只有1 種基因型，其中κ-CN 發(fā)現(xiàn)了一種新的等位基因D，揭示了單個(gè)牛奶樣品中酪蛋白基因型與蛋白膠束大小的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)κ-CN 以及αs1-CN 各亞型在乳蛋白D[3，2]上有顯著差異，等位基因?yàn)锳 的蛋白粒度要大于其他等位基因，篩選出的6 種αs1-β-κ-CN 復(fù)合基因型在乳蛋白D[3，2]以及D50 上有顯著差異，AB-BB-AB 的D[3，2]和D50 均為6 種復(fù)合基因型的最小值。研究結(jié)果表明乳蛋白多態(tài)性與酪蛋白膠束粒徑存在顯著關(guān)聯(lián)，為今后水牛品種的改良和原料乳品質(zhì)提高提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。