不同類型絲狀真菌發(fā)酵產(chǎn)酶性能比較及其混菌發(fā)酵性能研究

鄧加聰 郭偉靈 周文斌 洪家麗 李 路 劉繪鵬 劉 斌 陳紹軍 倪 莉 饒平凡 呂旭聰 *

（1 福建師范大學(xué)福清分校海洋與生化工程學(xué)院 食品與發(fā)酵工業(yè)研究所 福建福清 350300

2 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院 食品科學(xué)技術(shù)研究所 福州 350108

3 福建農(nóng)林大學(xué) 國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心 福州 350002

4 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院 福州 350002）

黃酒在世界釀造史上獨(dú)樹(shù)一幟，與啤酒、葡萄酒并稱為世界三大古酒，是中華民族的文化瑰寶，有著五千多年的悠久歷史，享有“國(guó)酒”之美譽(yù)。黃酒發(fā)酵是以谷物為主要原料，添加富含微生物的酒曲進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的過(guò)程[1]。酒曲微生物主導(dǎo)的代謝活動(dòng)是決定黃酒品質(zhì)的重要因素[2]。酒曲中微生物在釀造過(guò)程中的相互作用及其代謝產(chǎn)物，使發(fā)酵體系中各種物質(zhì)形態(tài)不斷演變，最終形成黃酒味醇、香濃等特征[3]。我國(guó)黃酒釀造用的酒曲中微生物復(fù)雜多樣，并隨酒曲種類、產(chǎn)地和制曲工藝的不同而存在差異，主要包括絲狀真菌、酵母菌和細(xì)菌3大類。

絲狀真菌在黃酒釀造中主要負(fù)責(zé)產(chǎn)液化酶和糖化酶，將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖供酵母菌利用，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為乙醇等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。此外，某些絲狀真菌還能夠產(chǎn)蛋白酶促進(jìn)蛋白質(zhì)水解轉(zhuǎn)化為氨基酸，增加了醪液中可被根霉菌和酵母菌等微生物利用的有機(jī)氮源氨基酸，促進(jìn)了根霉菌與酵母菌更健壯地生長(zhǎng)，使醪液中的糖更多地轉(zhuǎn)化為酒精，從而提高原料出酒率[4]。純種發(fā)酵擺脫了多種微生物共存的相互作用，可對(duì)單一目的菌株形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化和遺傳特性進(jìn)行研究。然而，長(zhǎng)期的試驗(yàn)和生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)純種菌株在發(fā)酵過(guò)程中難以完成或微弱進(jìn)行一些生化過(guò)程。單一菌種發(fā)酵難以克服發(fā)酵中間產(chǎn)物對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物造成的不利影響，導(dǎo)致其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味不及混菌發(fā)酵產(chǎn)品[5]。

混菌發(fā)酵是指采用兩種及以上菌株進(jìn)行混合發(fā)酵，其可利用微生物之間酶系的協(xié)同作用，有效提高酶活力，提高原料的利用率，降低其生產(chǎn)成本，同時(shí)使其產(chǎn)品具有濃郁的酒香味道。方華等[6]研究發(fā)現(xiàn)真菌混合培養(yǎng)時(shí)的酶系遠(yuǎn)復(fù)雜于單一真菌培養(yǎng)產(chǎn)酶之和，在混合培養(yǎng)體系中產(chǎn)酶種類或酶活力較單一真菌培養(yǎng)變化顯著，尤其是米曲霉和黑曲霉混合培養(yǎng)時(shí)能顯著提高蛋白酶活力。本文首先將實(shí)驗(yàn)室前期從福建紅曲黃酒釀造用曲中分離的4種絲狀真菌（黑曲霉、黃曲霉、米曲霉和米根霉）與臺(tái)灣生物資源研究及保存中心（BCRC）購(gòu)買(mǎi)的菌株進(jìn)行產(chǎn)酶性能比較，從中篩選出產(chǎn)液化酶、糖化酶和蛋白酶活力較高的菌株；其次，進(jìn)行單一菌株和兩兩混菌糯米試飯發(fā)酵，研究其產(chǎn)酶及產(chǎn)糖性能，為黃酒傳統(tǒng)釀造工藝的改進(jìn)和優(yōu)良產(chǎn)酶菌株的篩選提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與培養(yǎng)基

吐溫 80、可溶性淀粉、乙酸、乙酸鈉、3，5-二硝基水楊酸（DNS）、磷酸（H3PO4）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硫酸、碘、碘化鉀、福林酚試劑（Folin試劑）、碳酸鈉、三氯乙酸（TCA）均為分析純級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；麩皮和糯米，福州臺(tái)江農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

麩皮培養(yǎng)基：麩皮∶水＝1∶1（質(zhì)量比）；自然pH，121℃滅菌20min。

糯米培養(yǎng)基 ：糯米∶水=30∶36（質(zhì)量比）；自然pH，100℃滅菌60min。

1.2 菌株及其編號(hào)

表1 菌株及其編號(hào)Table1 Strains and their numbers

1.3 儀器與設(shè)備

電子天平TE601-L，德國(guó)賽多利斯公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱DHG-9123A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；超凈臺(tái)SW-CJ-IFD，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；手提式壓力蒸汽滅菌鍋YXOSG41280，上海醫(yī)用核子儀器廠；隔水式恒溫培養(yǎng)箱GNP-9080，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；普通光學(xué)顯微鏡XSB-3，上海光學(xué)儀器廠；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6，上海申滕上午技術(shù)有限公司；可見(jiàn)分光光度計(jì)UV-1600，上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 不同類型絲狀真菌發(fā)酵產(chǎn)酶性能比較 以麩皮培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行單一絲狀真菌菌株（黑曲霉AN19、黃曲霉AF20、米曲霉AO35、米根霉RO45、黑曲霉BCRC31494、黃曲霉BCRC31654、米曲霉BCRC30222和米根霉BCRC32229）發(fā)酵（接種量：106個(gè)孢子/g 糯米），在30℃下培養(yǎng)72 h，通過(guò)測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物的酶活力（糖化酶、液化酶、蛋白酶），從中篩選出產(chǎn)酶能力較高的絲狀真菌菌株。

1.4.2 不同類型絲狀真菌純菌和混菌試飯發(fā)酵 以糯米培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行純菌（接種量：106個(gè)孢子/g糯米）和兩兩混菌（接種量：每種菌0.5×106個(gè)孢子/g糯米）的糯米試飯發(fā)酵動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)，測(cè)定發(fā)酵過(guò)程酶活力（糖化酶、液化酶、蛋白酶）和還原糖的變化情況。

1.4.3 理化指標(biāo)的測(cè)定

1）糖化酶活力測(cè)定 取兩根試管A、B，分別加入0.1mL適量稀釋的酶液，然后加入0.5mL的2%可溶性淀粉乙酸乙酸鈉溶液，在40℃準(zhǔn)確反應(yīng)10min，立即加入0.4mL DNS試劑，在沸水浴中準(zhǔn)確煮沸5min，用水冷卻，最后定容至5.0mL，在波長(zhǎng)540 nm處測(cè)定吸光度[7]。

一個(gè)酶活單位的定義：在上述條件下每小時(shí)生成1 mg葡萄糖所需的酶量。酶活計(jì)算公式：

酶活力（U/g曲）=10×6×Y×D×a（1）

式中，10——0.1mL稀釋酶液換算成1mL；6——10min換算成1 h；Y——平均吸光度對(duì)應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)曲線的縱坐標(biāo)值；D——稀釋倍數(shù)；a——為浸提液酶活和曲酶活的換算系數(shù)。

2）液化酶活力測(cè)定 取3根試管加入適當(dāng)稀釋的酶液0.1mL，然后加入1mL 0.5%可溶性淀粉磷酸溶液，在40℃準(zhǔn)確反應(yīng)10mim后，用1 mL 0.1mol/L H2SO4終止反應(yīng)，取0.1mL反應(yīng)液與 1mL 碘液（0.4mmol/L I2-KI）顯色，在 620 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。以0.1mL水代替0.1mL反應(yīng)液為空白，以不加酶液（加同樣體積的pH 6.0磷酸緩沖液）的管為對(duì)照?？瞻?根試管，對(duì)照1根試管[7]。在上述條件下水解1mg淀粉的酶量定義為一個(gè)活力單位。酶活力計(jì)算公式：

酶活力（U/g曲）=[（A0-A）×50×D/A0]×b（2）

式中，A0，A——對(duì)照和反應(yīng)液的光密度；D——酶的稀釋倍數(shù)；b——浸提液酶活和曲酶活的換算系數(shù)。

3）蛋白酶活力測(cè)定 取2根試管，每管內(nèi)加入稀釋酶液1mL，置于40℃水浴中預(yù)熱2min，加入經(jīng)同樣預(yù)熱的酪蛋白1mL，精確保溫10min后立即再各加入0.4mol/L三氯乙酸2mL，以終止反應(yīng)，繼續(xù)置于水浴中保溫20min，使殘余蛋白質(zhì)沉淀后離心，另取2根試管，每管加入濾液1mL，再加0.4mol/L碳酸鈉5mL和已稀釋的福林試劑1 mL，搖勻，40℃保溫發(fā)色20min后在660 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行光密度（OD）測(cè)定。空白試驗(yàn)也取試管兩根，測(cè)定方法同上，唯在加酪蛋白之前先加0.4 mol/L三氯乙酸2mL，使酶失活，再加入酪蛋白。在40℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸定義為1個(gè)蛋白酶活力單位[8]。

樣品蛋白酶活力（U/g曲）=4×A×N×c/10（3）

式中，A——由樣品測(cè)得OD值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得相當(dāng)?shù)睦野彼豳|(zhì)量（μg）；4——4mL反應(yīng)液取出1mL測(cè)定（即4倍）；N——酶液稀釋的倍數(shù)；10——反應(yīng)10min；c——為浸提液酶活和曲酶活的換算系數(shù)。

4）還原糖含量測(cè)定 取2根試管A、B，分別加入0.1mL適量稀釋的酶液，再加入0.4mL DNS試劑，在沸水浴中準(zhǔn)確煮沸5min，用水冷卻，最后定容至5.0mL，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度?？瞻捉M：取1根試管C，加入0.1mL蒸餾水，然后加入0.4mL DNS試劑，然后在沸水浴中準(zhǔn)確煮沸5 min，用水冷卻，最后定容至5.0mL，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)液化酶、糖化酶及蛋白酶絲狀真菌菌種的篩選

成品曲在釀造過(guò)程產(chǎn)糖化酶、液化酶和蛋白酶活力是衡量酒曲質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，直接影響黃酒的品質(zhì)[9]。研究表明，較高的糖化酶、液化酶和蛋白酶活力，在發(fā)酵時(shí)可有效提高原料轉(zhuǎn)化率，從而獲得較高產(chǎn)酒率[7]；糖化酶是紅曲霉的重要初級(jí)代謝產(chǎn)物之一，主要由于其能有效降解淀粉中α-1，4-糖苷鍵、α-1，6-糖苷鍵和α-1，3-糖苷鍵連接的碳鏈?zhǔn)蛊涑浞炙獠⑥D(zhuǎn)化為葡萄糖，進(jìn)一步提高產(chǎn)酒率[10]；液化酶又稱α-淀粉酶可任意水解淀粉分子鏈內(nèi)的α-1，4-葡萄糖苷鍵產(chǎn)生小分子糖類，才能被酵母利用進(jìn)行發(fā)酵[11]。蛋白酶可破壞原料顆粒間質(zhì)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)原料碳?xì)浠衔锉┞?，提高其利用率，進(jìn)而促進(jìn)酒精發(fā)酵，且由于蛋白酶水解作用，提高了發(fā)酵料中氨基態(tài)氮的含量，進(jìn)一步提高其產(chǎn)酒率[12]。目前，為保證成品曲的糖化酶、液化酶和蛋白酶活力，通常采用麩皮培養(yǎng)基培養(yǎng)米曲霉、米根霉等絲狀真菌，將其按一定的比例混合進(jìn)行酒曲制作。本研究以實(shí)驗(yàn)室前期分離菌株和購(gòu)于臺(tái)灣地區(qū)的菌株為研究對(duì)象，經(jīng)發(fā)酵3 d測(cè)定其產(chǎn)糖化酶、液化酶和蛋白酶活力，結(jié)果如圖1。

由圖1可知，在產(chǎn)糖化酶、液化酶和蛋白酶方面，本實(shí)驗(yàn)室篩選的黃曲霉AF20都表現(xiàn)出較強(qiáng)能力，尤其在產(chǎn)糖化酶和液化酶都比其它菌株強(qiáng)。在糖化酶方面，本實(shí)驗(yàn)室篩選得到黃曲霉AF20和米根霉RO45都比來(lái)自臺(tái)灣地區(qū)的菌株強(qiáng)，在固態(tài)麩皮培養(yǎng)基上發(fā)酵3 d后糖化酶活力分別為（3 880.75±33.15） U/g和（2 644.66±99.46） U/g，液化酶活力分別為（3897.48±105.17）U/g和（3453.14±126.41）U/g。本實(shí)驗(yàn)室篩選的黑曲霉AN19和米曲霉AO35在產(chǎn)糖化酶和液化酶都比來(lái)自臺(tái)灣地區(qū)的菌株弱，在固態(tài)麩皮培養(yǎng)基上發(fā)酵3 d產(chǎn)糖化酶活力分別為（224.40±5.73）U/g和（971.66±138.64）U/g，液化酶活力分別為（452.23±33.05） U/g和（2 433.67±36.1）U/g。然而，相對(duì)黑曲霉AN19和米曲霉AO35，黑曲霉BCRC31494和米曲霉BCRC30222表現(xiàn)出較強(qiáng)產(chǎn)糖化酶和液化酶能力。實(shí)驗(yàn)室篩選的黃曲霉AF20和米根霉RO45產(chǎn)蛋白酶較來(lái)自臺(tái)灣地區(qū)的菌株相對(duì)較弱，黃曲霉AF20和米根霉RO45在固態(tài)麩皮培養(yǎng)基上發(fā)酵3 d，其蛋白酶活力分別為（460.55±21.24）U/g和（62.92±17.54）U/g。綜合考慮各類型絲狀真菌產(chǎn)糖化酶、液化酶和蛋白酶能力，最終選擇篩選出黃曲霉AF20、米根霉RO45、黑曲霉BCRC31494和米曲霉BCRC30222菌株進(jìn)一步做純菌和混菌的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)。

圖1 不同類型絲狀真菌發(fā)酵對(duì)酶活力的影響Fig.1 Effects of different types of filamentous fungi on fermentation on enzyme activity

2.2 4株優(yōu)良菌株單一菌株糯米試飯發(fā)酵產(chǎn)糖和產(chǎn)酶性能研究

對(duì)所選出4種類型絲狀真菌（黃曲霉AF20、米根霉RO45、米曲霉BCRC30222和黑曲霉BCRC31494）進(jìn)行了糯米試飯?jiān)囼?yàn)，動(dòng)態(tài)跟蹤發(fā)酵過(guò)程還原糖含量和液化酶活力，結(jié)果如圖2。

在釀造過(guò)程中，原料中淀粉可降解成還原糖、醇類和酯類等有機(jī)物的數(shù)量直接影響酒的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味，其中還原糖作為酵母發(fā)酵重要底物，其含量直接影響產(chǎn)酒率[13-14]。由圖2可知，接種純種米根霉RO45的培養(yǎng)基中還原糖含量先升高后降低，最終含量比其它3種絲狀真菌（黃曲霉AF20、米曲霉BCRC30222和黑曲霉BCRC31494）高，其它3種絲狀真菌（黃曲霉AF20、米曲霉BCRC30222和黑曲霉BCRC31494）培養(yǎng)基中還原糖含量無(wú)明顯差異。接種純種米根霉RO45在發(fā)酵的第3天，還原糖含量逐漸降低，可能由于米根霉利用培養(yǎng)基中還原糖進(jìn)行自身生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致其含量降低。

液化酶主要由釀造過(guò)程微生物產(chǎn)生，對(duì)發(fā)酵原料進(jìn)行分解，液化酶活力大小直接影響原料利用率[14]。由圖2可知，除黃曲霉AF20和米曲霉BCRC30222，其它2種絲狀真菌（米根霉RO45和黑曲霉BCRC31494）液化酶活力呈逐漸增加的趨勢(shì)。原因在于發(fā)酵初期，液化酶數(shù)量是影響其活力的主要限制條件，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成為限制液化酶活力的主要因素。黃曲霉AF20和米曲霉BCRC30222在發(fā)酵第5天時(shí)，液化酶活力有所下降，之后又有顯著上升趨勢(shì)。釀酒過(guò)程中，酒醅中淀粉被降解為還原糖、醇類、酯類等有機(jī)物，其降解率是評(píng)價(jià)酒的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、風(fēng)味和品質(zhì)還原糖含量是一個(gè)重要指標(biāo)[15-16]。由圖2可知，除實(shí)驗(yàn)室篩選的米根霉RO45外，其它3種絲狀真菌（黃曲霉AF20、米曲霉BCRC30222和黑曲霉BCRC31494）隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，還原糖含量逐漸增加，這主要由于發(fā)酵原料被降解轉(zhuǎn)化為還原糖，并在發(fā)酵液中逐漸積累。綜合考慮，接種米根霉RO45的培養(yǎng)基中還原糖含量高，而液化酶活力較強(qiáng)。

圖2 4株優(yōu)良菌株單一菌株糯米試飯發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量和液化酶活力的變化Fig.2 The changes of sugar content and amylase activity for the brew tests with glutinous rice of four types of filamentous fungi

2.3 4株優(yōu)良菌株兩兩混菌糯米試飯發(fā)酵對(duì)產(chǎn)酶性能和還原糖的影響

混合菌種發(fā)酵相對(duì)單一菌種發(fā)酵具有較強(qiáng)的發(fā)酵能力，發(fā)酵過(guò)程較為平穩(wěn)，穩(wěn)定期長(zhǎng)等特點(diǎn)，并可降低酒中尖酸、刺激和苦澀等不良風(fēng)味[17]。本試驗(yàn)選取4種類型絲狀真菌（米根霉RO45、黃曲霉AF20、米曲霉BCRC30222和黑曲霉BCRC31494）兩兩混合進(jìn)行糯米試飯?jiān)囼?yàn)，檢測(cè)其液化酶活力，結(jié)果如表2。

從傳統(tǒng)酒曲中分離絲狀真菌進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)根霉種類數(shù)量?jī)H次于曲霉[18]。由表2可知，米根霉RO45分別與黃曲霉AF20和米曲霉BCRC30222混合，都具有提高液化酶活力的作用，而與黑曲霉BCRC31494混合發(fā)酵7 d時(shí)，不如接種純菌株產(chǎn)生液化酶活力強(qiáng)。接種來(lái)自臺(tái)灣地區(qū)的米曲霉BCRC30222在任何發(fā)酵時(shí)間，除了與米根霉RO45混合發(fā)酵具有提高液化酶活力的作用以外，其它液化酶活力都低于接種單一絲狀真菌，可能由于米曲霉能降解輔料中的粗纖維，使其淀粉充分暴露，被米根霉進(jìn)一步水解，提高其液化酶活力。

黃曲霉廣泛用于制曲釀酒，可產(chǎn)生大量液化酶和蛋白酶，從釀造開(kāi)始到糖化，分解蛋白等作用，有助于縮短釀造周期[19]。檢測(cè)黃曲霉在發(fā)酵第7天液化酶活力為1 000.163U/g，其分別與米曲霉BCRC30222和黑曲霉BCRC31494混合培養(yǎng)，都導(dǎo)致其液化酶活力低于兩種中任何一種絲狀真菌。

由表3可知，接種純種米根霉RO45在發(fā)酵第3天還原糖含量達(dá)到最大值，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，還原糖含量降低且下降速度快。可能因?yàn)槊赘筊O45自身生長(zhǎng)繁殖消耗還原糖，使其還原糖含量下降。米根霉RO45與其它3種絲狀真菌混合發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量波動(dòng)較小，在發(fā)酵3 d后還原糖含量變化較小。結(jié)果表明，相對(duì)混合絲狀真菌發(fā)酵，純種米根霉具有糖化能力強(qiáng)，周期短等優(yōu)點(diǎn)[20]。絲狀真菌兩兩混合發(fā)酵，米根霉RO45和米曲霉BCRC30222混合發(fā)酵產(chǎn)生還原糖能力高于其它兩兩絲狀真菌混合發(fā)酵產(chǎn)還原糖能力，且遠(yuǎn)大于接種純種米曲霉產(chǎn)還原糖含量。

表2 不同類型絲狀真菌純菌、混菌發(fā)酵對(duì)產(chǎn)液化酶性能的影響Table2 Effects of pure and mixed fermentation of different types of filamentous fungi on liquefaction enzyme properties

表3 不同類型絲狀真菌純菌、混菌發(fā)酵對(duì)還原糖產(chǎn)量的影響Table3 Effects of pure and mixed fermentation of different filamentous fungi on reducing sugar production

酒曲品質(zhì)影響黃酒品質(zhì)，而蛋白酶活力是評(píng)價(jià)酒曲品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。蛋白酶可催化蛋白質(zhì)中肽鍵斷裂，具有效率高，條件溫和，有效保留蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值等優(yōu)點(diǎn)。由表4可知，米根霉RO45與米曲霉BCRC30222混合發(fā)酵第7天有效提高蛋白酶活力至70.180U/g，克服了米根霉純種發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶不足的缺點(diǎn)，并改變了米曲霉在發(fā)酵第5天蛋白酶活力下降的趨勢(shì)?？赡芤?yàn)槊浊乖诎l(fā)酵第5天，某中產(chǎn)物積累到一定量反而抑制其蛋白酶活力，而添加米根霉，可以延緩或抑制此現(xiàn)象的出現(xiàn)。

表4 不同類型絲狀真菌純菌、混菌發(fā)酵對(duì)產(chǎn)蛋白酶性能的影響Table4 Effects of pure and mixed fermentation of different types of filamentous fungi on protease properties

3 結(jié)論

1）比較實(shí)驗(yàn)室前期從福建紅曲黃酒釀造用曲中分離的和臺(tái)灣生物資源研究及保存中心（BCRC）購(gòu)買(mǎi)的不同絲狀真菌菌株（黑曲霉AN19、黃曲霉AF20、米曲霉AO35、米根霉RO45、黑曲霉BCRC31494、黃曲霉BCRC31654、米曲霉BCRC30222和米根霉BCRC32229）的產(chǎn)糖化酶活力、液化酶活力和蛋白酶活力。黃曲霉AF20和米根霉RO45均具有較強(qiáng)的產(chǎn)液化酶和糖化酶的活力，其中黃曲霉AF20還具有較高的產(chǎn)蛋白酶活力。黑曲霉BCRC31494和米根霉BCRC32229具有較高產(chǎn)液化酶、糖化酶和蛋白酶活力。綜合各種因素，篩選出產(chǎn)酶活力較高的4株不同類型絲狀真菌菌株：黃曲霉AF20、米根霉RO45、黑曲霉BCRC31494和米曲霉BCRC30222。

2）將篩選出的4株不同類型優(yōu)良菌株（黃曲霉AF20、米根霉RO45、黑曲霉BCRC31494和米曲霉BCRC30222）進(jìn)行糯米試飯發(fā)酵產(chǎn)糖和產(chǎn)酶性能的研究，發(fā)現(xiàn)接種純種米根霉RO45還原糖產(chǎn)量最高，而蛋白酶活力較低。進(jìn)一步將4種絲狀真菌進(jìn)行兩兩混合，測(cè)定其液化酶、蛋白酶活力和產(chǎn)還原糖性能，發(fā)現(xiàn)米根霉RO45與米曲霉BCRC30222、米根霉RO45與黃曲霉AF20兩兩混合發(fā)酵能夠顯著提高液化酶活力，其中米根霉RO45與米曲霉BCRC30222混合發(fā)酵不僅保持較高的液化酶活力和還原糖產(chǎn)量，還能夠顯著提升發(fā)酵體系中的蛋白酶活力。