叢林 周子力 馮濤 馬志躍

[關(guān)鍵詞]皮敏消膠囊;抗炎;抗過敏;藥理機(jī)制

皮敏消膠囊屬于中藥制劑，能夠發(fā)揮祛風(fēng)除濕、清熱解毒、涼血止癢、消腫散結(jié)等效果[1]，目前已經(jīng)被證實(shí)具有治療濕疹[2]、慢性蕁麻疹[3-4]的作用，以及對多種皮膚疾病例如玫瑰糠疹[5-6]、銀屑病[7-8]、皮膚瘙癢[9]等都有一定的功效，并且有研究表明，在臨床療效觀察中，皮敏消膠囊具有抗炎、抗過敏作用，能顯著降低患者的免疫球蛋白IgA、IgG、IgM水平，改善患者炎癥狀態(tài)，炎癥因子降鈣素原（Procalcitonin，PCT）、C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）水平也顯著下降[10]。盡管皮敏消膠囊的臨床療效已經(jīng)被證實(shí)，但是關(guān)于皮敏消膠囊的藥理作用機(jī)制研究目前仍為不足。本次主要對皮敏消膠囊的抗炎、抗過敏作用機(jī)制進(jìn)行了研究。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)藥品：皮敏消膠囊（四川德峰藥業(yè)有限公司，批號：180612）;醋酸地塞米松（浙江仙據(jù)制藥股份有限公司，批號：1805088）;阿司匹林腸溶片（石藥集團(tuán)歐意藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號：180722）。

1.2 試劑：伊文思藍(lán)、INF-γ、IL-4Elisa試劑盒、醋酸、二甲苯、卵白蛋白、NOS分型試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測定試劑盒、TNF-α蛋白抗體。

1.3 試驗(yàn)動物：昆明種普通級小鼠，雌雄兼用;SD清潔級大鼠，雌雄兼用。

1.4 試驗(yàn)細(xì)胞：LO2人源正常細(xì)胞。

1.5 儀器：萬分之一電子天平，低速自動離心機(jī)，超聲細(xì)胞破碎儀，酶標(biāo)儀，紫外分光光度計(jì)，超低溫冰箱。

1.6 實(shí)驗(yàn)方法

1.6.1 急性毒性試驗(yàn)：取昆明種健康小鼠10只，雌雄各半，以梯度濃度方式給藥10g/kg、25g/kg、50g/kg、100g/kg、200g/kg，每個濃度雌雄各一只，以灌胃方式給藥，連續(xù)觀察14d，詳細(xì)記錄動物反應(yīng)情況。

1.6.2 對小鼠耳廓腫脹的影響：取健康雄性小鼠，按體重隨機(jī)分層為3組，每組3只，分別給予藥物10g/kg、5g/kg、2.5g/kg作為試驗(yàn)組，以阿司匹林腸溶片（0.5g/kg）作為陽性對照組，以蒸餾水作為陰性對照組。各組灌胃給藥3d，1次/d。末次給藥后20min于小鼠右耳涂抹50μl二甲苯，10min后處死小鼠，沿耳廓邊緣剪下左右兩耳，用內(nèi)徑6.5mm的打孔器打下相同部位的左右二耳，稱重并以兩耳重量差為腫脹度。腫脹抑制率=（陰性對照組小鼠耳廓腫脹度-陽性對照組小鼠耳廓腫脹度）/陰性對照組小鼠耳廓腫脹度×100%。

1.6.3 對小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高的影響：取健康雄性小鼠，隨機(jī)分為3組，即皮敏消組（10g/kg、5g/kg、2.5g/kg）、蒸餾水組、阿司匹林組，各組灌胃給藥3d，1次/d。末次給藥后在各組小鼠尾處靜脈注射1%伊文思蘭溶液，注射量為0.1ml/10g，同時腹腔注射0.5%醋酸溶液0.1ml/只，于注射醋酸溶液后30min處死小鼠，用20ml生理鹽水沖洗腹腔，收集洗液，2 000r/min，離心10min，吸取上清液于590nm處測定吸光度值，以吸光度值反映小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性的改變。

1.6.4 對大鼠血清中IL-4、INF-γ含量的影響：取大鼠30只，隨機(jī)分成3組，即蒸餾水組、皮敏消膠囊組（10g/kg、5g/kg、2.5g/kg）、阿司匹林組，每組10只。以生理鹽水配制Al（OH）3懸液（10g/L），陰性對照組每次每只大鼠腹腔注射lml;其余各組大鼠均腹腔注射等量卵白蛋白與Al（OH）3懸液（1ml）的混合液進(jìn)行初次免疫，第10天重復(fù)1次。從初次免疫后第6天開始給藥或蒸餾水，共9d，每日1次。末次給藥后30min，在大鼠在未處死前于腹腔主動脈處取血，室溫靜置1h，待血清析出后，3 500r離心10min，取血清，分裝后-20℃冰箱凍存待行ELISA檢測。采用大鼠IFN-γ、IL-4酶聯(lián)免疫試劑盒，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，測定血清中IFN-γ、IL-4的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算濃度。并比較IFN-γ/IL-4的變化。

1.6.5 皮敏消膠囊對模型動物NO/NOS通路的影響：取9只大鼠，隨機(jī)分組，每組3只。以生理鹽水配制Al（OH）3懸液（10g/L），陰性對照組每次每只大鼠腹腔注射lml;其余各組大鼠均腹腔注射等量卵白蛋白與Al（OH）3懸液（1ml）的混合液進(jìn)行初次免疫，第10天重復(fù)1次。從初次免疫后第6天開始，分別給予蒸餾水、皮敏消（10g/kg、5g/kg、2.5g/kg）、地塞米松（5mg/kg），共給藥9d，每日1次，收集炎癥滲出液，按NOS分型試劑盒說明，測定滲出液中NOS、iNOS、NO含量。

1.6.6 肝炎模型的制備及小鼠血漿丙氨酸轉(zhuǎn)移酶活力的測定：每天2次連續(xù)7d灌胃給予皮敏消膠囊水溶液分為低（2.5g/kg）、中（5g/kg）、高（10g/kg）劑量三組，對照組給予蒸餾水，環(huán)飽菌素35mg/kg每隔2d腹腔注射。P.acnes負(fù)荷于灌胃給藥第3天開始。給藥第7天灌胃后30min尾靜脈注射后注射5μg/kg LPS-PBS溶液。小鼠在LPS注射8h后，在乙醚麻醉下心臟取血，置于肝素處理后的離心管中，3 000r/min離心10min，回收上清液儲存在-20℃用于分析。小鼠血漿丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性通過賴氏法檢測試劑盒測定。測定原理利用在37℃及pH7.4條件下，作用于丙氨酸及α-戊二酸組成的底物，生成丙酮酸及谷氨酸。反應(yīng)30min后，加入2，4一二硝基苯磷鹽酸溶液，終止反應(yīng)后492nm下測定OD值。

1.6.7 細(xì)胞毒性試驗(yàn)：將皮敏消溶解于DMSO中，以高劑量（200mg/ml）、中劑量（100mg/ml）、低劑量組（25mg/ml）對照三個組給藥LO2人源正常細(xì)胞于96孔板中，每孔LO2正常細(xì)胞3 000個，分別培養(yǎng)24、48、72h，加入MTT溶液后培養(yǎng)4h，棄去上清，加入DMSO溶解結(jié)晶紫后，于492nm下測定OD值，計(jì)算細(xì)胞生存率。

1.6.8 皮敏消對小鼠炎癥模型中的血清TNF-α含量的影響：以生理鹽水配制Al（OH）3懸液（10g/L），正常對照組每次每只大鼠腹腔注射lml;其余各組大鼠均腹腔注射等量卵白蛋白與Al（OH）3懸液（1ml）的混合液進(jìn)行初次免疫，第10天重復(fù)1次。從初次免疫后第6天開始，分別給予皮敏消（2.5g/kg、5g/kg、10g/kg），共給藥9d，每日1次并同樣給藥，3 500r/min離心10min，取血清，分裝后-20℃冰箱凍存。后續(xù)操作按照Western blot操作進(jìn)行測定。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x?±s）表示，多組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性毒性試驗(yàn)：試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，共有1只動物死亡，出現(xiàn)在觀察期第2天，死亡率10%（1/10）。解剖發(fā)現(xiàn)，胃內(nèi)充滿藥液，腸內(nèi)也可見。其余部分動物出現(xiàn)精神萎靡，蜷縮等現(xiàn)象。其中，200g/kg、100g/kg試驗(yàn)組均無其他不適，因此認(rèn)為該藥物灌胃給藥安全性高。

2.2 對小鼠因二甲苯所致的耳廓腫脹的影響：2.5g/kg皮敏消膠囊組、5g/kg皮敏消膠囊組、10g/kg皮敏消膠囊組及阿司匹林組小鼠的耳廓腫脹程度均低于蒸餾水組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.3 對小鼠腹腔毛細(xì)管通透性增高的影響：5g/kg皮敏消膠囊組和10g/kg皮敏消膠囊組小鼠的腹腔洗出液的吸光度值均低于蒸餾水組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

2.4 對大鼠血清中IL-4、INF-γ含量的影響：2.5g/kg皮敏消膠囊組、5g/kg皮敏消膠囊組、10g/kg皮敏消膠囊組及阿司匹林組的IL-4含量均低于蒸餾水組，而INF-γ和INF-γ/IL-4比值均高于蒸餾水組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05），見表3。

2 . 5 對NO/NOS通路的影響：2.5g/kg皮敏消膠囊組、5g/kg皮敏消膠囊組、10g/kg皮敏消膠囊組及地塞米松組的NOS、iNOS和NO含量均低于蒸餾水組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05），見表4。

2.6 肝炎模型小鼠血漿丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性：蒸餾水組小鼠血漿ALT（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶）平均值為（24.28±3.47）IU/L，P.acnes-LPS負(fù)荷小鼠血漿平均值為（249.58±9.44）IU/L。P.acnes-LPS負(fù)荷小鼠血漿活性ALT顯著升高，為肝損傷結(jié)果。與模型組相比，不同劑量皮敏消膠囊組血漿ALT水平顯著降低。低（2.5g/kg）、中（5g/kg）、高（10g/kg）劑量組小鼠血漿平均值分別為（178.44±3.69）IU/L、（148.47±6.99）IU/L及（134.79±9.96）IU/L。與模型組相比，皮敏消膠囊對小鼠血漿水平抑制率分別為21%、38%、47%，且呈一定量效關(guān)系。

2.7 細(xì)胞毒性試驗(yàn)：高劑量（200mg/ml）、中劑量（100mg/ml）、低劑量組（25mg/ml）三個劑量組下細(xì)胞存活率都接近100%，即幾乎無死細(xì)胞生成，無明顯生長抑制作用，提示皮敏消膠囊對于人源正常肝細(xì)胞LO2無毒性作用。見圖1（數(shù)據(jù)由Graphpad prism生成，圖表平均值為三時間段平均值）。

2.8 炎癥小鼠血清中TNF-α的含量：由圖2可知，皮敏消膠囊顯著調(diào)低了炎癥小鼠中TNF-α的表達(dá)量。

3 討論

皮敏消膠囊屬于中藥制劑，主要成分包括：蒼術(shù)、苦參、荊芥、防風(fēng)、蜈蚣、白鮮皮、牡丹皮、蒲公英、地黃、黃岑、紫草、蟬蛻、地骨皮等21味中藥;諸藥合用能夠發(fā)揮祛風(fēng)除濕、清熱解毒、涼血止癢、消腫散結(jié)等效果[1]，在臨床上常常用于聯(lián)合H1組胺抑制劑用于治療慢性蕁麻疹[4]，而對于濕疹也有一定作用[3]。

本次研究中，探討了皮敏消膠囊作為抗炎抗過敏藥物的毒性，明確皮敏消膠囊的安全有效。驗(yàn)證了，皮敏消膠囊在二甲苯致小鼠右耳腫脹實(shí)驗(yàn)[11]中、在醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增加的實(shí)驗(yàn)中均顯示了顯著的作用。通過測定大鼠血清中INF-γ和IL-4的含量，確定了皮敏消膠囊通過調(diào)節(jié)T輔助淋巴細(xì)胞（Th）的細(xì)胞因子，影響INF-γ和IL-4的相對含量，從而發(fā)揮抗過敏作用[12]。NOS是一種含鐵血紅蛋白酶，與細(xì)胞色素還原酶類似，目前研究發(fā)現(xiàn)存在三種亞型，即誘生性（iNOS）、內(nèi)皮型（eNOS）、神經(jīng)型（nNOS）。其中，iNOS屬于非鈣依賴性酶，內(nèi)毒素、IL-1、腫瘤壞死因子和干擾素-γ分泌時，可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生iNOS。iNOS可催化產(chǎn)生一氧化氮（NO）具有抗腫瘤、抗病原微生物等作用。然而iNOS的持續(xù)激活，又可以介導(dǎo)過量NO的產(chǎn)生，從而造成過強(qiáng)的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致炎癥、變態(tài)反應(yīng)的產(chǎn)生[10]。本研究表明，皮敏消膠囊也能夠有效地降低NOS、iNOS以及下游的NO含量，從而發(fā)揮抗炎效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)測定了肝炎模型小鼠中ALT[13]的活性，皮敏消顯著的抑制了ALT的升高，一定程度上保護(hù)了由于P.acnes-LPS[14]誘導(dǎo)的肝炎細(xì)胞，說明皮敏消膠囊確實(shí)具有抗炎的功效。實(shí)驗(yàn)還測定了在LO2細(xì)胞[15]中測定了皮敏消膠囊的毒性，與預(yù)想一樣，皮敏消膠囊并無細(xì)胞毒性。另外實(shí)驗(yàn)還通過Westernblot定性檢測了炎癥因子TNF-α[16-17]這個重要指標(biāo)的含量，結(jié)果顯示皮敏消膠囊可以顯著降低TNF-α的含量，從而起到抗炎作用。

在臨床治療中，皮敏消膠囊能夠顯著緩解蕁麻疹、濕疹這類疾病，而對于一些并不典型的皮膚瘙癢、過敏等癥狀，也能夠明顯治療，這與皮敏消膠囊能夠發(fā)揮抗炎抗過敏作用有關(guān)。在臨床治療中，皮敏消膠囊一般用于與組胺受體抑制劑西替利嗪、特非那定等聯(lián)合使用，但也有單獨(dú)使用的案例。本研究明確了皮敏消膠囊的藥理作用，從蛋白、細(xì)胞、動物三個不同層次水平上闡述了皮敏消膠囊的藥理作用機(jī)制，確定了皮敏消膠囊的抗炎抗過敏活性，與很多天然化合物的廣泛藥理活性類似[18-19]，這也為將來皮敏消膠囊的更廣泛的臨床應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。