劉少斌 劉子宸 孟嫦娟 張翠麗

頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）屬于惡性癌癥的一種[1]，該病主要發(fā)生在患者頭頸部，多生長(zhǎng)在口腔、鼻腔和喉嚨等位置[2]。該病患者5年生存率約為30%～40%，生存率較低的原因是鱗狀細(xì)胞癌易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)[3]。如癌細(xì)胞發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，患者的生存率都將降低至10%，在全球惡性腫瘤名單中HNSCC排第六位[4]?？谘树[狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是頭頸部最常見的惡性腫瘤，此癌癥占全身惡性腫瘤的1.3%，占頭頸癌的4.2%。多生長(zhǎng)在患者會(huì)厭、舌根和咽壁等位置[5]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國(guó)每年增加OSCC患者約50萬例，通常OSCC的發(fā)病機(jī)制和病理類型都不同，發(fā)生的原因可能與機(jī)械損傷、煙草和酒精等因素有關(guān)[6]。microRNA是一類非編碼RNA，microRNA具有廣泛的生物學(xué)作用和內(nèi)源調(diào)節(jié)功能，能調(diào)控人體接近一半的蛋白編碼基因的表達(dá)[7]。microRNA可促進(jìn)mRNA降解并抑制靶基因mRNA轉(zhuǎn)錄，從而起到抑制靶基因的作用。miR-214位1號(hào)染色體q24.3位點(diǎn)的長(zhǎng)鏈非編碼Dmn3os轉(zhuǎn)錄本中，參與人體血管生成、骨組織形成等，廣泛參與人體的生物學(xué)進(jìn)程[8]。大量研究顯示，在多種癌癥中都檢測(cè)到了miR-214的表達(dá)異常，參與調(diào)控癌細(xì)胞的增殖、耐藥和轉(zhuǎn)移等[9]。1991年，Notch1發(fā)現(xiàn)于人T淋巴白血病中，研究人員首次將Notch1與癌癥聯(lián)系起來[10]。Notch1信號(hào)通路在人體神經(jīng)性疾病和機(jī)體發(fā)育中都發(fā)揮著重要作用，例如：介入并調(diào)整了細(xì)胞凋亡、侵襲、遷移及血管的產(chǎn)生等生理病理歷程[11]。研究顯示，Notch1是很多關(guān)鍵信號(hào)的交匯點(diǎn),該信號(hào)能直接激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[12]。在不同癌癥中，Notch1可能通過抑制癌細(xì)胞增殖或誘導(dǎo)凋亡來體現(xiàn)自身作用[13]。因此，本篇文章通過分析三組癌細(xì)胞的凋亡及增殖情況、Notch1的蛋白含量、Notch1 mRNA的表達(dá)含量的差異性來研究miR-214通過調(diào)控Notch1信號(hào)對(duì)OSCC細(xì)胞株增殖、侵襲及凋亡的作用機(jī)制。

資料與方法

一、資料

1.一般資料：在ATCC細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買OSCC細(xì)胞株（HN6口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系）。

2.實(shí)驗(yàn)儀器與試劑：胰蛋白酶（美國(guó)Life公司）；miR-214 mimics、inhibitors（百奧邁科生物技術(shù)有限公司）；恒溫?fù)u床（成都蘇凈器材公司）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)：取 60 μl細(xì)胞懸液，每組 20 μl。第1組對(duì)照組（CO組）：?jiǎn)渭僌SCC細(xì)胞株不做其他處理正常培養(yǎng)；第2組模擬組（SI組）：將miR-214 mimics轉(zhuǎn)染到OSCC細(xì)胞株中；第3組抑制組（IN組）：將miR-214 inhibitors轉(zhuǎn)染到OSCC細(xì)胞株中。將OSCC細(xì)胞株在含有胎牛血清的DMEM培育液中培養(yǎng)，在10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培育，放入孵箱中（37 ℃，5%CO2）培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞數(shù)量為80%～90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，800×g離心5 min，收集細(xì)胞，加入培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，重懸細(xì)胞，按1 : 3傳代細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞數(shù)量為80%～90%時(shí)，收集、重懸并繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，用于實(shí)驗(yàn)。

2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將miR-214 mimics和inhibitors溶于49 μl無血清培養(yǎng)基中，混勻，溫育5 min。選擇合適的混合比例（1 : 1-1 : 2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量）來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。將OSCC細(xì)胞稀釋至2×105個(gè)/ ml，平鋪到24孔板中。待OSCC細(xì)胞密度生長(zhǎng)為70%～80%時(shí)加入合適體積的無血清培養(yǎng)基，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將稀釋的OSCC細(xì)胞加入培養(yǎng)皿中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h，棄去上層液體，更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h。采用qRT-PCR法檢測(cè)miR-214 mimics和inhibitors是否轉(zhuǎn)染成功。

3.TUNEL法檢測(cè)OSCC細(xì)胞凋亡：將OSCC細(xì)胞置于六孔板內(nèi)，待OSCC細(xì)胞密度生長(zhǎng)為70%～80%時(shí)。按TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行標(biāo)記染色，加Vectashield Hard Set 封固涂片樣本，標(biāo)記反應(yīng)，DAPI/TUNEL/merge熒光標(biāo)記液和TUNEL檢測(cè)液混合，使用甲基綠進(jìn)行細(xì)胞核染色，凋亡細(xì)胞核被染成綠色，未凋亡的細(xì)胞核染成紅色。高倍鏡下（×400）每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，分別觀察每個(gè)視野的凋亡OSCC細(xì)胞數(shù)。凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)。

4.CCK-8法檢測(cè)OSCC細(xì)胞增殖情況：將所有細(xì)胞分別重懸計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ ml，然后按每孔100 μl的量分別接種于96孔板中，室溫條件下放入CO2孵育箱中培養(yǎng)，空白孔加入200 μl PBS減少孵育過程液體蒸發(fā)，然后向孔中加入 CCK-8 試劑 10 μl（直接加入板底）。37 ℃培養(yǎng)24 h，酶標(biāo)儀各孔在450 nm光密度值（Optical density，OD）做好記錄，統(tǒng)計(jì)，整理并分析數(shù)據(jù)，得出最終結(jié)果。

5.Transwell 檢測(cè)OSCC細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：取出轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，稀釋為1×105個(gè)/ml，在血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h。準(zhǔn)備Transwell小室，上室鋪ECM膠，下室加500 μl含10%血清培養(yǎng)基，靜置4 h，吸出液體，殘留液風(fēng)干。取200 μl培養(yǎng)好的細(xì)胞接種在transwell遷移室中。24 h后，取出細(xì)胞，乙醇固定，結(jié)晶紫溶液染色，顯微鏡（×100）觀察。

6.Western Blot法檢測(cè)OSCC中Notch1的蛋白含量：取OSCC細(xì)胞50 μg，洗凈烘干電泳槽及其它部件，制備12%分離膠，制作1 cm的水層。將電泳裝置放置聚膠1 h，配制灌注成層膠。90 V電泳，溴酚藍(lán)倒入分離膠，取出凝膠，放入PVDF膜5～10 s。加進(jìn)轉(zhuǎn)膜液，冰浴，70 V，1.5 h。PVDF膜置于封閉液，4 ℃過夜（雜交液稀釋一抗，GAPDH: 1 : 1 000）。清洗3次，把膜放入對(duì)應(yīng)的二抗中常溫孵育1.5 h，輕輕晃動(dòng)。加入ECLA和B混合液約1 min，PVDF膜檢測(cè)采用自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析。

7.qRT-PCR法檢測(cè)OSCC中Notch1 mRNA、miR-214mRNA的表達(dá)含量：將各組OSCC細(xì)胞株以5×104個(gè)/ml濃度置于12孔板中（有蓋玻片），用4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗滌，0.5% Triton處理10 min；PBS洗滌，用濃度為3% BSA 封閉1 h；PBS洗滌，培育24 h，PBS洗滌3次，加入一抗（1 : 200）在室溫、無光的條件下培育1 h，用PBS洗滌3次，加入二抗（1 : 1 000），在室溫、無光的條件下孵育 10 min，PBS洗滌 2次，4 ℃，1 200×g離心5 min，加異丙醇，離心，加75%乙醇離心，干燥，-80 ℃保存。反轉(zhuǎn)錄體系：94 ℃15 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，72 ℃ 10 min，重復(fù) 40 次反轉(zhuǎn)錄體系，最后計(jì)算。（表1）

表1 引物序列

8.雙熒光素酶報(bào)告基因：轉(zhuǎn)染效率高的OSCC被用于進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，OSCC消化后鋪于12孔板中，將Notch1-UTR質(zhì)粒與miR-214 mimics共轉(zhuǎn)染至OSCC中，同時(shí)將Notch1-UTR突變株質(zhì)粒與miR-214 inhibitors共細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染6 h后更換為完全培養(yǎng)基，60 h后裂解細(xì)胞行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。miR-214mRNA、細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲、Notch1表達(dá)用表示，兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，三組癌細(xì)胞的凋亡情況、增殖情況、Notch1蛋白含量、Notch1 mRNA表達(dá)含量的差異性采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、qRT-PCR法檢測(cè)OSCC中miR-214mRNA的表達(dá)含量

結(jié)果顯示，IN組OSCC細(xì)胞內(nèi)的miR-214mRNA表達(dá)量最低1.15±0.26，SI組OSCC細(xì)胞內(nèi)的miR-214mRNA表達(dá)量最高3.34±0.89，SI組分別與IN組、CO組（2.08±0.67）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.281，P=0.002；t=2.529，P=0.045，圖1）。

圖1 三組口咽鱗狀癌細(xì)胞中miR-214mRNA表達(dá)量

二、雙熒光素酶報(bào)告基因

轉(zhuǎn)構(gòu)建載體后行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，結(jié)果顯示，SI組、IN組的Notch1-UTR表達(dá)分別為0.42±0.11、0.86±0.09，轉(zhuǎn)染 miR-214后能夠降低Notch1的活性，對(duì)突變基因的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.362，P=0.006，圖2）。

三、TUNEL法檢測(cè)OSCC細(xì)胞凋亡情況

SI組、IN組和CO組平均凋亡率分為0.32%、0.78%、0.56%，SI組癌細(xì)胞凋亡數(shù)量最少，IN組癌細(xì)胞大量凋亡，IN組和CO組、SI組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.149，P=0.020；t=8.823，P＜0.001，圖3，表2）。

四、CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

IN組癌細(xì)胞的增殖情況低于SI組及CO組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.056，P＜0.001；t=27.394，P＜0.001），CO 組癌細(xì)胞的增殖率低于 SI組（t=12.365，P＜0.001，表2）。

五、Transwell檢測(cè)OSCC細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

對(duì)三組癌細(xì)胞進(jìn)行Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)，SI組癌細(xì)胞侵襲能力強(qiáng)，顯微鏡下細(xì)胞數(shù)量多，IN組癌細(xì)胞顯微鏡下細(xì)胞數(shù)量少，侵襲能力弱，SI組與CO組、IN組相比較癌細(xì)胞數(shù)量增多，整體侵襲能力增強(qiáng)（t=4.176，P=0.006；t=10.147，P＜0.001，圖4，表2）。

六、Western Blot法檢測(cè)OSCC中Notch1的蛋白含量

根據(jù)灰度分析顯示，IN 組的Notch1 蛋白含量最高，SI 組的 Notch1 蛋白含量最低，SI組（0.94±0.23）分別與CO組（1.76±0.67）、IN組（2.38±1.34）比較Notch1蛋白含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.588，P=0.041；t=2.368，P=0.056，圖5，6）。

圖2 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-214與Notch1-UTR結(jié)合情況

圖3 光學(xué)顯微鏡下觀察三組口咽鱗狀癌細(xì)胞凋亡情況（甲基綠染色，×400）

圖4 光學(xué)顯微鏡下觀察三組口咽鱗狀癌細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)（結(jié)晶紫溶液染色，×400）

七、qRT-PCR法檢測(cè)OSCC中Notch1 mRNA的表達(dá)含量

結(jié)果顯示，SI組癌細(xì)胞內(nèi)的 Notch1 mRNA表達(dá)量最低，IN組癌細(xì)胞內(nèi)的Notch1 mRNA表達(dá)量最高，IN組（4.26±1.06）分別與CO組（2.46±0.87）、SI組（1.45±0.38）相比較表達(dá)量上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.935，P=0.026；t=5.583，P=0.001）。

表2 三組細(xì)胞凋亡率、增殖率、侵襲率比較（%，±s）

表2 三組細(xì)胞凋亡率、增殖率、侵襲率比較（%，±s）

注：與CO 組比較，aP＜0.05，與IN 組比較，bP＜0.05

分組 實(shí)驗(yàn)次數(shù) 細(xì)胞凋亡率 增殖率 侵襲率CO 組 3 0.56±0.12 1.26±0.06 0.48±0.11 IN 組 3 0.78±0.10a 0.65±0.05a 0.13±0.02a SI組 3 0.32±0.06b 1.89±0.04b 0.89±0.13b F值 17.013 299.627 48.369 P值 0.003 ＜0.001 ＜0.001

圖5 三組口咽鱗狀癌細(xì)胞中Notch1的蛋白含量

圖6 三組口咽鱗狀癌細(xì)胞中Notch1蛋白含量比較

討 論

口腔鱗狀細(xì)胞癌多發(fā)生于口腔中舌根、咽壁等部位，是惡性癌癥的一種[14]。早期癥狀不明顯，容易被忽略，所以一般被發(fā)現(xiàn)時(shí)疾病都發(fā)展為中晚期，治療效果不理想，5年生存率較低[15]。常見癥狀為咽部不適、異物感，逐漸出現(xiàn)咽痛，甚至引起耳內(nèi)痛[16]。晚期患者常有唾液帶血、口臭、呼吸不暢等癥狀。腫瘤增大后會(huì)造成吞咽困難，呼吸道阻塞[17]。該腫瘤極易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，為治療帶來了一定難度，是死亡率增加的主要原因[18]。因此，提高咽癌診治手段，早診斷、早治療，是治療口腔鱗狀細(xì)胞癌重要基礎(chǔ)。

經(jīng)TUNEL染色，SI組癌細(xì)胞凋亡數(shù)量最少，IN組癌細(xì)胞大量凋亡，IN組和CO組、SI組相比較癌細(xì)胞分布稀疏，數(shù)量減少。組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)IN組和SI組之間OD值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，IN組癌細(xì)胞的增殖數(shù)量最少，SI組癌細(xì)胞的增殖數(shù)量最多，IN組癌細(xì)胞的增殖情況低于CO組，CO組癌細(xì)胞的增殖情況低于SI組。對(duì)三組癌細(xì)胞進(jìn)行Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。由結(jié)果可知，SI組癌細(xì)胞侵襲能力強(qiáng)，顯微鏡下細(xì)胞數(shù)量多，IN組癌細(xì)胞顯微鏡下細(xì)胞數(shù)量少，侵襲能力弱，SI組和CO組、IN組相比較癌細(xì)胞數(shù)量增多。根據(jù)灰度分析顯示，IN組的Notch1蛋白含量最高，SI組的Notch1蛋白含量最低，SI組和CO組、IN組相比較Notch1蛋白含量降低。結(jié)果顯示，SI組癌細(xì)胞內(nèi)的Notch1 mRNA表達(dá)量最低，IN組癌細(xì)胞內(nèi)的Notch1 mRNA表達(dá)量最高，IN組和CO組、SI組相比較表達(dá)量上升。由結(jié)果可知，miR-214可能通過下調(diào)Notch1信號(hào)通路的表達(dá)，降低Notch1的蛋白含量與Notch1 mRNA水平，從而促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲。這一結(jié)果與Wang等[19]在miR-214通過PI3K / AKT /mTOR信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制食管鱗狀細(xì)胞癌的凋亡中得出的在食管鱗狀細(xì)胞癌中miR-214發(fā)揮促癌基因的作用。通過構(gòu)建載體后行雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-214后能夠降低Notch1的活性，miR-214與多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖能力密切相關(guān)，對(duì)癌細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移具有重要意義，這與本文的研究結(jié)果一致。Notch1在OSCC的發(fā)生發(fā)展過程中起著十分重要的作用。上調(diào)Notch1在OSCC中的表達(dá)能抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲。miR-214有望成為OSCC的標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對(duì)Notch1基因的操縱可能為OSCC的分子靶向治療提供理論依據(jù)的結(jié)果一致[20]。

綜上所述，miR-214可能與OSCC細(xì)胞株增殖呈負(fù)相關(guān)，在細(xì)胞中miR-214含量升高，可能抑制Notch1信號(hào)通路表達(dá)，從而促進(jìn)癌細(xì)胞增長(zhǎng)、侵襲，抑制癌細(xì)胞凋亡。