吳儀凡，葛武鵬,*，劉凱茹，宋宇軒，趙麗麗，張文博，王雨馨，梁秀珍

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省羊乳產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，陜西 富平 711700；3.陜西中檢檢測(cè)技術(shù)有限公司，陜西西安710068；4.陜西飛天乳業(yè)有限公司，陜西寶雞721100）

綿羊乳口感細(xì)膩，富含蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、礦物質(zhì)和維生素等營(yíng)養(yǎng)成分[1-2]。綿羊乳的總?cè)楣腆w、脂肪、蛋白質(zhì)和乳糖含量均高于山羊乳，有“乳中新貴”之稱[3-5]。湖羊是我國(guó)著名的綿羊品種之一，東佛里生羊是世界著名的乳肉兼用型綿羊品種[6-8]。但目前關(guān)于湖羊和東佛里生羊乳營(yíng)養(yǎng)成分及其乳清蛋白組成的研究較少，綿羊乳的開(kāi)發(fā)利用仍處于初級(jí)階段。研究不同品種、不同泌乳周期綿羊乳的宏量營(yíng)養(yǎng)素構(gòu)成與含量，能夠?yàn)楹侠砝觅Y源、開(kāi)發(fā)綿羊乳加工產(chǎn)品提供參考依據(jù)。

乳制品作為優(yōu)質(zhì)動(dòng)物性蛋白的主要來(lái)源，其包含的各類蛋白均具有一定的生物活性和功能[9-11]。人乳中含量最為豐富的是乳清蛋白，其易于消化吸收，對(duì)嬰幼兒的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。乳清蛋白主要包含α-乳白蛋白（α-lactalbumin，α-LA）、β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，β-LG）、血清白蛋白（serum albumin，SA）、免疫球蛋白（immunoglobulin，IgG）和乳鐵蛋白（lactoferrin，LF）等[12-14]，不同品種及不同泌乳階段綿羊乳營(yíng)養(yǎng)特性及乳清蛋白組成的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。本研究重點(diǎn)解析綿羊乳乳清蛋白組成，既有助于區(qū)分綿羊乳與山羊乳和牛乳，又能為綿羊乳功能性產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用提供參考。以山羊乳、牛乳、人乳為對(duì)照，分析比較湖羊、東佛里生羊、東湖雜交一代羊乳及不同泌乳時(shí)間綿羊乳的基本營(yíng)養(yǎng)成分和乳清蛋白組成差異，重點(diǎn)比較綿羊乳與山羊乳、牛乳、人乳乳清蛋白組分的差異，篩選差異蛋白標(biāo)志物，為綿羊乳質(zhì)量監(jiān)控及綿羊乳摻假鑒別提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來(lái)源

綿羊乳采自甘肅省金昌市，包含湖羊、東佛里生羊、東湖雜交一代羊（簡(jiǎn)稱雜一代）3 個(gè)品種，采集湖羊初乳、湖羊乳（30 d）、東佛里生羊初乳、東佛里生羊乳（15、90 d）、雜一代羊乳（15、30 d）；山羊乳采自西北農(nóng)林科技大學(xué)克隆羊基地；人乳采自健康女性志愿者；牛乳采自西北農(nóng)林科技大學(xué)畜牧教學(xué)試驗(yàn)基地奶牛場(chǎng)。山羊乳、人乳、牛乳均為常乳。收集乳樣后，用干冰迅速冷卻，利用4 ℃冰盒運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，于-80 ℃凍藏備用。

1.1.2 試劑

DM131彩虹180廣譜蛋白Marker 北京全式金生物技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒西安赫特生物科技有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺、冰醋酸上海展云化工有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）德州同威新材料科技有限公司；過(guò)硫酸銨上海埃彼化學(xué)試劑有限公司；丙烯酰胺上?；菡\(chéng)生物科技有限公司；甘氨酸、考馬斯亮藍(lán)R250上海源葉生物科技有限公司；N,N-亞甲基丙烯酰胺德州曼巴商貿(mào)有限公司；甲醇天津康科德科技有限公司；溴酚藍(lán)沈陽(yáng)從科化工有限公司；β-巰基乙醇北京百奧萊博科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Milko Scan FT120多功能乳品分析儀丹麥Foss公司；Mini P-4伯樂(lè)小型垂直電泳槽北京凱元信瑞有限公司；VictorX3多功能酶標(biāo)儀美國(guó)PE公司；ChemiDoc MP化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)美國(guó)Bio-Rad公司；JY600C電泳儀北京君意東方電泳有限公司；HH-2電熱恒溫水浴鍋北京科偉永興儀器有限公司；ZONKIA HC-3018高速離心機(jī) 安徽中科中佳有限公司；SHZ-82恒溫振蕩器常州國(guó)華電器有限公司；PB-10 pH計(jì)德國(guó)賽多里斯科學(xué)儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式真空泵鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳樣營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定

取30 mL乳樣，用多功能乳品分析儀測(cè)定其基本營(yíng)養(yǎng)成分（總?cè)楣腆w、非脂乳固體、脂肪、乳糖、總蛋白、酪蛋白）含量，每個(gè)樣品測(cè)定3 次。

1.3.2 乳清蛋白分離

取40 mL乳樣，4 ℃、5 000 r/min條件下離心30 min，分離上層脂肪，于脂肪層中加入3 mL去離子水，混勻后再次離心10 min，去除上層脂肪，將下層乳液和第1次離心收集的下層乳液混合，即為脫脂乳。

乳清蛋白分離：將收集的脫脂乳用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至酪蛋白等電點(diǎn)（綿羊乳、山羊乳等電點(diǎn)均為4.1，牛乳等電點(diǎn)4.6，人乳等電點(diǎn)4.3），室溫靜置40 min，在4 ℃、5 000 r/min條件下離心10 min，沉淀酪蛋白，收集上清液；將3 mL去離子水加入酪蛋白層，再次離心10 min，將上清液與第1次離心收集的上清液混合，即為乳清蛋白溶液。

乳清蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定：利用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定乳清蛋白溶液中乳清蛋白的質(zhì)量濃度。將每種乳樣的乳清蛋白質(zhì)量濃度均調(diào)整為4 mg/mL。

1.3.3 電泳分析

1.3.3.1 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）樣品制備

將乳清蛋白溶液與等體積的2×SDS上樣緩沖液（含去離子水8.0 mL、0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）2.0 mL、丙三醇1.6 mL、10 g/100 mL SDS 3.2 mL、10 mg/mL溴酚藍(lán)0.4 mL、β-巰基乙醇75 μL）混合，沸水浴5 min，冷卻至室溫，再在5 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液用于SDS-PAGE分析。

1.3.3.2 Native-PAGE樣品制備

將乳清蛋白溶液與等體積的2×非變性上樣緩沖液（含去離子水5.5 mL、0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）1.25 mL、丙三醇3.0 mL、10 mg/mL溴酚藍(lán)0.2 mL）混合，然后在4 ℃、5 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液用于Native-PAGE分析。

1.3.3.3 電泳條件

SDS-PAGE和Native-PAGE的濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為4%，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.5%，上樣量為15 μL，設(shè)定濃縮膠電流15 mA，分離膠電流30 mA。當(dāng)溴酚藍(lán)指示劑距分離膠底部1 cm處時(shí)停止電泳。其中，SDS-PAGE在室溫條件下進(jìn)行，Native-PAGE在0～4 ℃條件下進(jìn)行，防止蛋白質(zhì)在電泳過(guò)程中變性。電泳結(jié)束后，將凝膠用考馬斯亮藍(lán)染液（含45%甲醇、10%醋酸、0.1%考馬斯亮藍(lán)R250）染色1 h，用脫色液（含25%甲醇、10%醋酸）脫色至蛋白條帶清晰可見(jiàn)，用蒸餾水浸泡1 h后，用凝膠成像系統(tǒng)成像并拍照[15]。利用Image La軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel、SPSS 18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總及單因素方差分析、Duncan’s多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為顯著水平，P＜0.01為極顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 綿羊乳與山羊乳、牛乳及人乳營(yíng)養(yǎng)成分差異分析

由表1可知：綿羊乳總?cè)楣腆w含量極顯著高于山羊乳、牛乳和人乳（P＜0.01）；東佛里生羊初乳、雜一代羊乳、湖羊初乳非脂乳固體含量極顯著高于其他乳（P＜0.01）；綿羊乳脂肪含量顯著高于山羊乳、牛乳和人乳（P＜0.05），其中湖羊初乳脂肪含量最高；與其他品種乳相比，人乳的乳糖含量最高，這一結(jié)果與李龍柱[16]、陳天鵬[17]等的報(bào)道一致，綿羊乳乳糖含量與山羊乳、牛乳無(wú)顯著差異；東佛里生羊乳（15、90 d）總蛋白、酪蛋白含量與山羊乳無(wú)顯著差異，但羊乳中總蛋白、酪蛋白含量極顯著高于牛乳和人乳（P＜0.01）。由此可知，不同品種的綿羊乳與山羊乳、牛乳及人乳的營(yíng)養(yǎng)成分存在顯著性差異。

表1 羊乳與山牛乳及人乳基本營(yíng)養(yǎng)成分差異分析Table 1tritional components of sheep, goat, cow and human milk

湖羊初乳的總?cè)楣腆w、非脂乳固體、脂肪、乳糖、總蛋白、酪蛋白含量顯著高于湖羊常乳（30 d）（P＜0.05）；東佛里生羊初乳的總?cè)楣腆w、非脂乳固體、脂肪、總蛋白、酪蛋白含量顯著高于東佛里生羊常乳（15、90 d）（P＜0.05），乳糖含量顯著低于東佛里生羊常乳（P＜0.05），這一結(jié)果與買買提伊明·巴拉提[2]、娜日娜[18]、馬友記[19]等研究多浪羊、小尾寒羊和甘肅肉綿羊初乳和常乳變化的結(jié)果一致。隨泌乳時(shí)間增加，東佛里生羊乳、雜一代羊乳的總?cè)楣腆w、非脂乳固體、脂肪、總蛋白、酪蛋白含量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，東佛里生羊乳糖含量呈增加趨勢(shì)。由此可知，不同品種綿羊乳的營(yíng)養(yǎng)成分隨泌乳周期的變化而變化。

2.2 綿羊乳與山羊乳、牛乳、人乳乳清蛋白組成差異分析

2.2.1 SDS-PAGE分析結(jié)果

由圖1可知，綿羊乳、山羊乳、牛乳及人乳乳清蛋白主要由α-LA、β-LG、SA、IgG和LF 5 種蛋白質(zhì)組成，不同乳種乳清蛋白組成存在較大差異。

α-LA是必需氨基酸和支鏈氨基酸的極好來(lái)源，也是唯一能與金屬元素和鈣元素結(jié)合的乳清蛋白成分，綿羊乳中的α-LA在氨基酸結(jié)構(gòu)比例和功能特性上與人乳均非常相似[20]，α-LA的色氨酸及半胱氨酸含量很高，而高含量的色氨酸和半胱氨酸能夠激發(fā)免疫系統(tǒng)活性，對(duì)于嬰兒免疫力的提高及睡眠質(zhì)量的改善有重要作用[21]。東佛里羊乳和雜一代羊乳中α-LA含量均明顯高于湖羊乳、山羊乳、人乳及牛乳。β-LG可溶性強(qiáng)，支鏈氨基酸含量豐富，是乳清蛋白中半胱氨酸和甲硫氨酸的主要來(lái)源，β-LG具備最佳的氨基酸比例，能夠?qū)χ苄誀I(yíng)養(yǎng)素進(jìn)行預(yù)結(jié)合，從而促進(jìn)人體的吸收[22]。綿羊乳、山羊乳和牛乳中β-LG含量豐富。SA能夠與代謝物、維生素及金屬離子等結(jié)合，在血液循環(huán)中可作為許多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的存儲(chǔ)和轉(zhuǎn)運(yùn)載體[23]，東佛里生羊乳（15 d）及人乳中的SA含量較高。IgG是乳清蛋白中熱敏感性最強(qiáng)的一種蛋白質(zhì)，IgG是因外源大分子抗原刺激而產(chǎn)生的一種抗體，在巰基乙醇和SDS的變性作用下IgG裂解為IgG-H（重鏈）和IgG-L（輕鏈）[24]。綿羊乳和山羊乳的IgG-H含量明顯高于牛乳和人乳，含量由高到低依次為湖羊初乳、山羊乳、湖羊乳（30 d）、人乳、牛乳。LF有抗菌性、抗病毒性，具有參與體內(nèi)鐵代謝、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等作用[25]。人乳中LF含量最高，其次為山羊乳，綿羊乳中LF含量明顯低于人乳和山羊乳，但明顯高于牛乳，不同品種和泌乳階段的綿羊乳L(zhǎng)F含量也存在明顯差異。

圖1 綿羊乳、山羊乳、牛乳及人乳乳清蛋白的SDS-PAGE圖Fig. 1SDS-PAGE of whey proteins in sheep, goat, cow and human milk

綜上可知，區(qū)分綿羊乳和人乳的標(biāo)志性蛋白為β-LG和LF，區(qū)分綿羊乳和山羊乳的標(biāo)志性蛋白為α-LA，區(qū)分綿羊乳和牛乳的標(biāo)志性蛋白為IgG-H。

2.2.2 Native-PAGE分析結(jié)果

由圖2可知，綿羊乳、山羊乳、人乳、牛乳乳清蛋白在Native-PAGE中呈現(xiàn)明顯差異。綿羊乳乳清蛋白主要有2 個(gè)明顯的蛋白條帶，分別為條帶1、2；山羊乳乳清蛋白主要有3 個(gè)蛋白條帶，分別為條帶1、2、3，綿羊乳與山羊乳之間的差異性蛋白條帶為條帶3；人乳乳清蛋白主要有4 個(gè)蛋白條帶，牛乳乳清蛋白也主要有4 個(gè)蛋白條帶，除了條帶1，人乳中的其他乳清蛋白組分分子質(zhì)量均小于牛乳乳清蛋白。宋宏新等[26]已通過(guò)Native-PAGE很好地區(qū)分了牛乳與山羊乳，本研究通過(guò)對(duì)綿羊乳、山羊乳、牛乳和人乳乳清蛋白進(jìn)行Native-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)這4 種乳源中乳清蛋白組分之間均存在差異。因此，Native-PAGE也可作為鑒別綿羊乳、山羊乳、牛乳摻假的有效方法。

圖2 綿羊乳、山羊乳、牛乳及人乳乳清蛋白的Native-PAGE圖Fig. 2 Native-PAGE of whey proteins in sheep, goat, cow and human milk

3 結(jié)論

以山羊乳、牛乳和人乳為對(duì)照，對(duì)不同泌乳階段的湖羊乳、東佛里生羊乳、東湖雜交一代羊乳的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行分析，利用SDS-PAGE和Native-PAGE研究乳樣的乳清蛋白組成差異。結(jié)果表明：不同品種的綿羊乳與山羊乳、牛乳、人乳的蛋白質(zhì)、脂肪、總?cè)楣腆w含量之間存在顯著差異（P＜0.05）；不同品種綿羊乳的部分營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)隨泌乳階段的變化具有一定趨勢(shì)性規(guī)律；通過(guò)SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)，綿羊乳和人乳的LF、β-LG含量存在差異，綿羊乳和山羊乳的α-LA含量存在差異，綿羊乳和牛乳的IgG-H含量存在差異；通過(guò)Native-PAGE發(fā)現(xiàn)，綿羊乳與山羊乳乳清蛋白之間存在1 條差異性條帶，綿羊乳與人乳、牛乳乳清蛋白之間存在3 條差異性條帶，這些差異蛋白可作為鑒別綿羊乳、山羊乳、牛乳摻假的標(biāo)志性蛋白。