趙平，柏凡,2，龔均，趙菊輝，史海濤，董蕾

幽門(mén)螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)是一種革蘭陰性、微需氧菌。已有越來(lái)越多的證據(jù)表明H.pylori是消化性潰瘍、慢性胃炎、胃癌及胃黏膜相關(guān)淋巴組織樣淋巴瘤的主要致病因素[1-3]，根除H.pylori對(duì)治療和預(yù)防上述疾病具有重要意義。我國(guó)人群H.pylori感染率高達(dá)35%～80%[4]。隨著H.pylori根除治療的普及和推廣，H.pylori對(duì)抗生素的耐藥問(wèn)題呈現(xiàn)出日益嚴(yán)重的趨勢(shì)，尤其是出現(xiàn)較高比例的雙重、多重耐藥菌株[5]，導(dǎo)致了越來(lái)越多的患者出現(xiàn)H.pylori根除治療失敗，從而難以達(dá)到80%以上的根除率。 正確選擇抗生素并制定有效的根除治療方案是根治H.pylori成功的關(guān)鍵。受地域、經(jīng)濟(jì)、環(huán)境等因素的影響，不同地區(qū)H.pylori抗生素耐藥情況存在一定的差異[6-7]，因此對(duì)不同地區(qū)H.pylori抗生素耐藥情況進(jìn)行監(jiān)測(cè)，可以指導(dǎo)該地區(qū)的臨床合理用藥。本研究對(duì)進(jìn)行胃鏡檢查的H.pylori陽(yáng)性患者進(jìn)行H.pylori分離、培養(yǎng)、鑒定，并對(duì)所得H.pylori菌株進(jìn)行6種常用抗生素藥敏檢測(cè)，分析陜西省西安地區(qū)H.pylori感染及抗生素耐藥情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究通過(guò)西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后實(shí)施。收集2016年11月至2017年11月在西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院行胃鏡檢查的H.pylori陽(yáng)性慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、復(fù)合性潰瘍及胃癌患者。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～77歲；②胃鏡證實(shí)為慢性非萎縮性胃炎、慢性萎縮性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、復(fù)合性潰瘍及胃癌，且快速尿素酶檢測(cè)顯示H.pylori感染的患者；③近4周內(nèi)未使用質(zhì)子泵抑制劑、H2受體拮抗劑、抗生素、鉍劑；④同意取胃黏膜活檢組織標(biāo)本進(jìn)行H.pylori培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)；⑤依從性好且簽署知情同意書(shū)。 排除標(biāo)準(zhǔn)：①妊娠或哺乳期婦女；②合并嚴(yán)重的心血管、呼吸、血液、肝腎、神經(jīng)或內(nèi)分泌系統(tǒng)性疾病者；③有消化性潰瘍伴有穿孔、出血并發(fā)癥者；④精神病、嚴(yán)重神經(jīng)官能癥等不能正確表達(dá)自己主訴的患者；⑤服用非甾體類抗炎藥、抗凝藥物或酗酒的患者。所有患者均在胃鏡下距幽門(mén)5 cm處鉗取1塊胃竇黏膜組織進(jìn)行H.pylori快速尿素酶檢測(cè),陽(yáng)性后另于胃竇取1 塊組織進(jìn)行H.pylori培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)。共收集胃黏膜樣本320例，其中男性樣本182例，女性樣本138例?；颊吣挲g21～77歲，平均(49.43±14.15)歲。胃黏膜標(biāo)本采集后置于含5%甘油的腦心浸液中，-80 ℃保存，分批干冰運(yùn)輸，送至杭州致遠(yuǎn)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所進(jìn)行H.pylori的分離培養(yǎng)、鑒定及抗生素敏感性測(cè)試。

1.2 H.pylori分離培養(yǎng)和鑒定

將胃黏膜組織樣本充分研磨后接種于含5%新鮮去纖維蛋白綿羊血的哥倫比亞瓊脂平板(Oxoid，英國(guó))上，于37 ℃三氣培養(yǎng)箱中微需氧環(huán)境(5% O2，10% CO2，85% N2)培養(yǎng)，96 h 后觀察菌落的生長(zhǎng)情況?？梢删浣?jīng)肉眼觀察、革蘭氏染色鏡檢，菌體形態(tài)符合，且過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶和尿素酶試驗(yàn)陽(yáng)性的菌株判定為H.pylori陽(yáng)性，如未發(fā)現(xiàn)可疑菌落，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間至第7天。

1.3 抗生素敏感性測(cè)試

將6種不同抗生素溶液分別加入瓊脂稀釋至相應(yīng)的臨界點(diǎn)耐藥濃度，傾注平板；用移液器加2～3 μL菌懸液于平板上，待其干燥后，置于37 ℃三氣培養(yǎng)箱中微需氧環(huán)境(5% O2，10% CO2，85% N2，濕度>80%)中培養(yǎng)72 h后判讀藥敏結(jié)果，若接種點(diǎn)有菌生長(zhǎng)，則該菌株判讀為耐藥。臨界點(diǎn)耐藥值的設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)：甲硝唑 8 μg/mL，克拉霉素1 μg/mL，左氧氟沙星2 μg/mL，阿莫西林2 μg/mL，呋喃唑酮2 μg/mL，四環(huán)素2 μg/mL。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)數(shù)資料以n或%表示，選擇2檢驗(yàn)對(duì)計(jì)數(shù)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 H.pylori陽(yáng)性檢出率及其影響因素

2.1.1H.pylori培養(yǎng)檢出率及與性別的關(guān)系 對(duì)收集的320份胃黏膜組織進(jìn)行微需氧環(huán)境下分離培養(yǎng)，檢出H.pylori共138 株，培養(yǎng)檢出率為43.13%。有藥敏檢測(cè)結(jié)果H.pylori121株，藥敏培養(yǎng)檢出率為37.81%。H.pylori在男性患者中的培養(yǎng)檢出率略高于女性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，H.pylori在男性患者中的藥敏培養(yǎng)檢出率略高于女性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。H.pylori培養(yǎng)檢出率及與性別的關(guān)系見(jiàn)表1。

2.1.2H.pylori培養(yǎng)檢出率與疾病類型的關(guān)系 將患者分為慢性非萎縮性胃炎組、慢性萎縮性胃炎組、胃潰瘍組、十二指腸潰瘍組、復(fù)合性潰瘍組及胃癌組，各組的H.pylori培養(yǎng)檢出率之間有顯著差異(2=36.921，P=0.000)；各組的H.pylori藥敏培養(yǎng)檢出率之間有顯著差異(2=29.590，P=0.000)；其中，胃潰瘍組的H.pylori培養(yǎng)檢出率及藥敏培養(yǎng)檢出率顯著高于慢性非萎縮性、慢性萎縮性胃炎及胃癌組(P<0.05)，十二指腸潰瘍組的H.pylori檢出率顯著高于慢性非萎縮性、慢性萎縮性胃炎及胃癌組(P<0.05)，十二指腸潰瘍組的H.pylori培養(yǎng)檢出率顯著高于慢性萎縮性胃炎及胃癌組(P<0.05)。H.pylori培養(yǎng)的檢出率與疾病類型的關(guān)系見(jiàn)表2。

表2 不同疾病患者H.pylori培養(yǎng)陽(yáng)性率比較[n(%)]

2.2 H.pylori菌株對(duì)6種抗生素的耐藥情況

所檢121株H.pylori菌株對(duì)甲硝硅、克拉霉素、左氧氟沙星耐藥率相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=90.516，P=0.000)。所檢121株H.pylori菌株對(duì)甲硝唑的耐藥率最高，達(dá)80.17%,對(duì)克拉霉素的耐藥率為24.79%，對(duì)左氧氟沙星的耐藥率為30.58%,對(duì)阿莫西林、四環(huán)素與呋喃唑酮均敏感。見(jiàn)表3。

2.3 H.pylori的多重耐藥情況

所檢121株H.pylori菌株對(duì)所有抗生素均敏感的僅有11株(占9.09%)，單藥耐藥68株(占56.20%)，多重耐藥42株(占34.71%)，其中，雙重耐藥30株(占24.79%)，三重耐藥12株(占9.92%)。H.pylori菌株均敏感、單藥耐藥、雙重耐藥、三重耐藥率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=93.829，P=0.000)。單藥耐藥中甲硝唑的耐藥率最高, 共55株(占45.45%)，雙重耐藥中耐藥最多的是甲硝唑+左氧氟沙星, 共16株(占13.22%)。見(jiàn)表4。

表3 H.pylori對(duì)3種抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果[株(%)]

2.4 不同類型疾病的H.pylori對(duì)抗生素的耐藥情況比較

H.pylori對(duì)甲硝唑的耐藥率在不同類型疾病之間比較無(wú)明顯差異。H.pylori對(duì)克拉霉素的耐藥率在十二指腸潰瘍、胃潰瘍、復(fù)合性潰瘍組中高于其他疾病組，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無(wú)顯著性。H.pylori對(duì)左氧氟沙星的耐藥率在慢性非萎縮性胃炎、十二指腸潰瘍組中高于其他疾病組，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無(wú)顯著性。見(jiàn)表5。

3 討論

本研究顯示，H.pylori的培養(yǎng)檢出率為43.13%，與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[8-10]。 本研究中，男性的H.pylori培養(yǎng)陽(yáng)性率高于女性。以往報(bào)道顯示，男性H.pylori感染率比女性高，有人認(rèn)為，女性從衛(wèi)生保健系統(tǒng)接觸抗生素的機(jī)會(huì)增加，具體來(lái)說(shuō)，在她們的一生中，女性比男性更多地獲得抗生素，由此導(dǎo)致男女H.pylori感染率差異，男性的H.pylori培養(yǎng)陽(yáng)性率高于女性可能也由此引起[11]。

表4 H.pylori對(duì)不同抗生素的多重耐藥結(jié)果[株(%)]

本研究結(jié)果顯示，消化性潰瘍的H.pylori培養(yǎng)陽(yáng)性率顯著高于慢性胃炎。以往研究表明，H.pylori陽(yáng)性受試者的組織學(xué)評(píng)分高于陰性受試者[12-14]。H.pylori感染后，細(xì)菌會(huì)立即引起胃黏膜急性炎癥反應(yīng)，隨后會(huì)演變成慢性活動(dòng)性胃炎，可影響胃竇導(dǎo)致胃酸分泌增加，從而與十二指腸潰瘍相關(guān)，而以胃體為主的胃炎是胃潰瘍的危險(xiǎn)因素，根除細(xì)菌可顯著降低潰瘍復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[15-16]。消化性潰瘍的H.pylori培養(yǎng)陽(yáng)性率顯著高于慢性胃炎也表明消化性潰瘍患者的H.pylori活力及細(xì)菌負(fù)荷量高于慢性胃炎患者。

本研究結(jié)果顯示，胃癌患者胃黏膜H.pylori培養(yǎng)陽(yáng)性率較低。H.pylori感染使發(fā)生非賁門(mén)胃癌的風(fēng)險(xiǎn)增加6倍[17]，H.pylori如何導(dǎo)致癌癥的發(fā)生尚不明確，H.pylori間接損傷胃上皮細(xì)胞發(fā)生炎癥，另外H.pylori通過(guò)細(xì)菌毒素直接調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞，兩者的共同作用促進(jìn)胃癌的發(fā)生[18]。目前認(rèn)為H.pylori感染后胃腺癌是通過(guò)胃炎→萎縮→腸化生→異型增生→癌的順序發(fā)展[16]。胃癌患者胃黏膜H.pylori培養(yǎng)陽(yáng)性率較低，可能與H.pylori難于定植在已腸化、萎縮的胃黏膜，已腸化、萎縮的胃黏膜局部H.pylori細(xì)菌負(fù)荷量少有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，西安地區(qū)H.pylori對(duì)甲硝唑、克拉霉素、左氧氟沙星耐藥率分別為80.17%、24.79%、30.58%，與以往的研究相比[19]，大部分抗生素的耐藥率較前升高。對(duì)四環(huán)素、呋喃唑酮無(wú)耐藥菌株，可能與本地這兩種抗生素可獲得性差有關(guān)。從研究結(jié)果可以看出，6種抗生素中耐藥率最高的是甲硝唑，其次為左氧氟沙星，阿莫西林、四環(huán)素、呋喃唑酮本次未發(fā)現(xiàn)耐藥。甲硝唑多年來(lái)一直作為根除H.pylori的主要藥物，此外還被廣泛用于婦科及口腔科疾病的治療，這可能是導(dǎo)致其耐藥率迅速增加的原因。西安地區(qū)H.pylori對(duì)甲硝唑的耐藥率為80.17%，仍處于較高的耐藥水平。本次檢測(cè)克拉霉素耐藥率為24.79%，較2013年的33.9%有所下降[19]。左氧氟沙星是喹諾酮類藥物，被廣泛用于呼吸道、消化道及泌尿系感染，本次檢查仍處較高的耐藥水平?？死顾爻Ｓ糜谥委熒虾粑栏腥?。一項(xiàng)北京地區(qū)10年間常用根治H.pylori抗菌素耐藥率對(duì)比研究顯示，克拉霉素的耐藥率在10 年間升高趨勢(shì)明顯，既往使用克拉霉素治療失敗的患者在沒(méi)有進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)的情況下反復(fù)用克拉霉素治療，容易導(dǎo)致H.pylori的難治性感染[20]。本地區(qū)克拉霉素耐藥率大于15%，已不適合應(yīng)用不含鉍劑的三聯(lián)療法根治H.pylori。本次檢測(cè)分離的H.pylori對(duì)四環(huán)素、阿莫西林、呋喃唑酮無(wú)耐藥菌株。但由于四環(huán)素、呋喃唑酮存在較多臨床不良反應(yīng)，在無(wú)藥敏結(jié)果之前，阿莫西林可作為經(jīng)驗(yàn)用藥。

本研究發(fā)現(xiàn)西安地區(qū)H.pylori雙重耐藥率為24.79%，其中對(duì)克拉霉素和甲硝唑雙重耐藥率為11.57%，左氧氟沙星和甲硝唑雙重耐藥率為13.22%，三重耐藥率為9.92%。本地區(qū)根治H.pylori應(yīng)盡可能選用耐藥率低的抗生素聯(lián)合治療，以防更多的多重耐藥的產(chǎn)生，影響根除效果。

國(guó)內(nèi)外報(bào)道的不同疾病類型H.pylori分離株對(duì)甲硝唑和克拉霉素的耐藥率有差異。有回顧不同國(guó)家H.pylori對(duì)抗生素耐藥性的數(shù)據(jù)分析研究結(jié)果顯示，非潰瘍性消化不良患者對(duì)克拉霉素的耐藥率較高，而消化性潰瘍患者對(duì)甲硝唑的耐藥率較高[21]。本研究中，分別比較H.pylori對(duì)各抗菌藥物的耐藥率與疾病類型之間的關(guān)系，各項(xiàng)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能與所獲取的菌株總量、疾病來(lái)源及地區(qū)差異有關(guān)。