李軍，胡濤，周東生，王青濤，魏冬

食管癌是發(fā)生在食管上皮組織的惡性腫瘤，占所有惡性腫瘤的2%，全球每年約有30萬(wàn)人死于食管癌。中國(guó)是世界上食管癌的高發(fā)國(guó)家，也是世界上食管癌高死亡率的國(guó)家之一，平均每年病死約15萬(wàn)人[1]。叉頭框蛋白家族(FOX)是一類(lèi)DNA結(jié)合區(qū)具有翼狀螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)控、胚胎的發(fā)育以及腫瘤的發(fā)生，在生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，許多FOX蛋白與人類(lèi)癌癥有關(guān)，且可以作為藥物靶標(biāo)進(jìn)行治療[2]。叉頭框蛋白N3(FOXN3)是FOX蛋白家族的一員，已有研究表明其在大多數(shù)惡性腫瘤中充當(dāng)腫瘤抑制因子的角色[3]。例如FOXN3在骨肉瘤中下調(diào)并轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)沉默信息調(diào)節(jié)因子6(SIRT6)抑制骨肉瘤細(xì)胞遷移和侵襲[4]。FOXN3過(guò)表達(dá)可能會(huì)抑制急性髓細(xì)胞白血病(AML)細(xì)胞系中的細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期S期停滯并促進(jìn)OCI-AML3和THP-AML細(xì)胞凋亡[5]。而Wnt/β-catenin(β-連環(huán)蛋白)信號(hào)通路是最經(jīng)典的致癌信號(hào)傳導(dǎo)通路之一，該信號(hào)通路的過(guò)度激活通常會(huì)導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生，例如食管癌、肝癌、肺癌等[6]。目前，F(xiàn)OXN3在食管癌中的功能作用仍然未知，本研究通過(guò)探究FOXN3對(duì)食管癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的作用，并進(jìn)一步研究相關(guān)機(jī)制，為探討食管癌新的治療方法提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

RPMI 1640培養(yǎng)基、Lipofectamine 2000試劑(ThermoFisher公司)，10%胎牛血清(Hyclone公司)，食管癌細(xì)胞、食管上皮細(xì)胞HEEC(中國(guó)科學(xué)院上海生科院)，pcDNA3.1載體質(zhì)粒、pcDNA3.1-FOXN3載體質(zhì)粒(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，所有引物(廣州銳博公司)，Cell Counting Kit-8試劑盒(CCK-8，同仁化學(xué)研究所)，V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Sigma Aldrich公司)，PI-RNase A試劑(FuDunBio公司)，cleaved-Caspase-3兔單克隆抗體(ab32042)、Ki-67兔單克隆抗體(ab92742)、MMP-2兔單克隆抗體(ab92536)、Wnt1兔多克隆抗體(ab15251)、β-catenin兔單克隆抗體(ab32572)、GAPDH兔單克隆抗體(ab181602)，山羊抗兔IgG二抗(ab6721，上海Abcam公司)。

FACS細(xì)胞儀、CellQuest軟件3.3版(BD Biosciences公司)，Transwell小室(上海生博生物公司)，培養(yǎng)箱(ThermoFisher公司)，化學(xué)發(fā)光成像儀(GENE GNOME)、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Thermo labsystem公司)，IX71倒置顯微鏡、CellSens Dimension軟件(Olympus公司)。

1.2 RT-qPCR檢測(cè)Eca-109、KYSE-30和TE-1的表達(dá)水平

使用Trizol試劑提取來(lái)自食管上皮細(xì)胞HEEC、食管癌細(xì)胞Eca-109、KYSE-30和TE-1的總RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA合成cDNA，然后進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 15 s，退火56 ℃ 60 s，72℃延伸2 min，共循環(huán)35次。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt的方法進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物見(jiàn)表1。并選取FOXN3表達(dá)量最低的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

表1 Real-time PCR引物

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

所有細(xì)胞均在含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養(yǎng)基中，并在37 ℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d傳代一次。將表達(dá)量最低的Eca-109細(xì)胞以2×105個(gè)/孔的密度接種到6孔組織培養(yǎng)板中，將細(xì)胞分為FOXN3過(guò)表達(dá)組、空載體對(duì)照組和對(duì)照組，其中對(duì)照組不做處理。用6 μg/mL的pcDNA3.1-FOXN3或pcDNA3.1轉(zhuǎn)染Eca-109細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后，將各組細(xì)胞轉(zhuǎn)移至完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別作為FOXN3過(guò)表達(dá)組和空載體對(duì)照組。收集對(duì)數(shù)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖

將各組細(xì)胞懸浮液稀釋至2×103個(gè)/mL，接種至96孔板(100 μL/孔)中。向每個(gè)孔中加入10 μL Cell Counting Kit-8溶液后，將板在培養(yǎng)箱中孵育1 h，并在450 nm處測(cè)量吸光度在24、48和72 h后用酶標(biāo)儀讀取。根據(jù)吸光度值繪制細(xì)胞增殖曲線(xiàn)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期

收集轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞，用PBS洗滌兩次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，重懸于500 μL結(jié)合緩沖液中。加入Annexin V-FITC和PI溶液在避光條件下25 ℃孵育15 min。PBS洗滌兩次后，用FACS細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的速率。收集細(xì)胞，用PBS洗滌兩次，在-20 ℃下用75%乙醇固定細(xì)胞1 h。PBS洗滌后置于PI-RNase A試劑中，在室溫下避光孵育25 min，PBS洗滌后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。用CellQuest軟件進(jìn)行分析。

1.6 Transwell檢測(cè)各組細(xì)胞侵襲水平

將8 μm膜孔徑12孔的Transwell小室放入培養(yǎng)板中，上室加入接種在200 μL無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基中濃度為5×104個(gè)/孔的各組細(xì)胞懸液，下室加入600 μL含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h，清除未穿透的細(xì)胞，并將剩余的細(xì)胞在95%乙醇中固定15 min，然后用0.1%結(jié)晶紫染色15 min。在倒置顯微鏡(×200)下成像，并計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。

1.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移水平

在培養(yǎng)皿的背面劃過(guò)5條直線(xiàn)，間隔為0.5～1.0 cm。在培養(yǎng)皿中加入2 mL濃度為2.5×105個(gè)/ mL的各組細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。使用無(wú)菌10 μL移液器吸頭垂直于五根基線(xiàn)進(jìn)行一次刮擦。然后，用PBS洗滌細(xì)胞并添加2 mL無(wú)血清培養(yǎng)基以觀察細(xì)胞。通過(guò)Olympus IX71倒置顯微鏡在0、24 h捕獲劃痕圖像，用Olympus CellSens Dimension軟件分析劃痕的寬度。重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。

1.8 Western blot檢測(cè)cleaved-Caspase-3、Ki-67、MMP-2、Wnt1和β-catenin蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞，用RIPA裂解并提取細(xì)胞總蛋白，加入5×上樣緩沖液，沸水浴后分裝保存蛋白質(zhì)樣品。通過(guò)SDS-PAGE(10%)分離蛋白質(zhì)樣品，并與相應(yīng)的一抗[cleaved-Caspase-3 (1∶1 000)、Ki-67 (1∶5 000)、MMP-2 (1∶5 000)、Wnt1 (1∶1 000)、β-catenin (1∶5 000)、GAPDH (1∶10 000)]在4 ℃下孵育過(guò)夜。第2天室溫復(fù)溫并漂洗后加入山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)孵育，在化學(xué)發(fā)光成像儀內(nèi)顯影。重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 FOXN3在食管癌細(xì)胞中的表達(dá)

食管癌細(xì)胞Eca-109、KYSE-30、TE-1中FOXN3的相對(duì)表達(dá)量較食管上皮細(xì)胞HEEC顯著下降(P<0.05)，其中Eca-109細(xì)胞FOXN3相對(duì)表達(dá)量最低，選取用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖1。

2.2 過(guò)表達(dá)FOXN3抑制Eca-109細(xì)胞增殖

與對(duì)照組和空載體對(duì)照組比較，F(xiàn)OXN3過(guò)表達(dá)組細(xì)胞增殖能力顯著下降(P<0.05)，Ki-67蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.3 過(guò)表達(dá)FOXN3促進(jìn)Eca-109細(xì)胞凋亡

FOXN3過(guò)表達(dá)組細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組和空載體對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，且過(guò)表達(dá)FOXN3后，Eca-109細(xì)胞G0/G1期比例顯著升高，S期比例顯著下降(P<0.05)，cleaved-Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖3，提示過(guò)表達(dá)FOXN3阻滯Eca-109細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

圖1 FOXN3在食管癌細(xì)胞中的表達(dá) 與食管上皮細(xì)胞HEEC比較，*P<0.05

圖2 過(guò)表達(dá)FOXN3抑制Eca-109細(xì)胞增殖 A：三組細(xì)胞增殖趨勢(shì)；B：三組細(xì)胞Ki-67蛋白表達(dá)。與對(duì)照組比較，*P<0.05；與空載體對(duì)照組比較，#P<0.05

圖3 過(guò)表達(dá)FOXN3促進(jìn)Eca-109細(xì)胞凋亡 A：三組細(xì)胞凋亡結(jié)果圖；B：三組細(xì)胞細(xì)胞周期圖；C：三組細(xì)胞cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)。與對(duì)照組比較，*P<0.05；與空載體對(duì)照組比較，#P<0.05

2.4 過(guò)表達(dá)FOXN3抑制Eca-109細(xì)胞侵襲和遷移

FOXN3過(guò)表達(dá)組細(xì)胞侵襲能力以及MMP-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平較對(duì)照組和空載體對(duì)照組顯著下降(P<0.05)，劃痕寬度顯著大于對(duì)照組和空載體對(duì)照組(P<0.05)，提示過(guò)表達(dá)FOXN3抑制Eca-109細(xì)胞侵襲和遷移，見(jiàn)圖4。

2.5 過(guò)表達(dá)FOXN3抑制Wnt信號(hào)通路

與對(duì)照組和空載體對(duì)照組比較，F(xiàn)OXN3過(guò)表達(dá)組Wnt1和β-catenin蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著下降(P<0.05)，說(shuō)明過(guò)表達(dá)FOXN3對(duì)Wnt信號(hào)通路起到抑制作用，見(jiàn)圖5。

圖4 過(guò)表達(dá)FOXN3抑制Eca-109細(xì)胞侵襲和遷移 A：三組細(xì)胞侵襲數(shù)目；B：三組細(xì)胞劃痕寬度；C：三組細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)。與對(duì)照組比較，*P<0.05；與空載體對(duì)照組比較，#P<0.05

圖5 過(guò)表達(dá)FOXN3抑制Wnt信號(hào)通路 與對(duì)照組比較，*P<0.05；與空載體對(duì)照組比較，#P<0.05

3 討論

食管癌是原發(fā)于食管的惡性腫瘤，主要表現(xiàn)為吞咽食物時(shí)哽咽感、異物感、胸骨后疼痛或明顯的吞咽困難。多數(shù)患者在診斷時(shí)已是晚期，化療過(guò)程中易出現(xiàn)耐藥，盡管目前對(duì)食管癌患者的管理和治療有所改善，但總的預(yù)后依舊很差，食管癌切除術(shù)后5年生存率約15%～40%，因此需要尋找有效的生物靶點(diǎn)[7-8]。FOXN3在許多器官中廣泛表達(dá)，包括肝、胰腺、腎臟、肺和骨髓；在胚胎發(fā)育、組蛋白修飾、DNA損傷反應(yīng)、細(xì)胞周期進(jìn)程、新陳代謝中起著不可或缺的作用[9-11]。越來(lái)越多的研究表明，F(xiàn)OXN3是癌癥的潛在治療靶標(biāo)，可以通過(guò)致癌活性調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生。Sun等[12]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXN3在體外抑制人原發(fā)性肝癌(HCC)的增殖，在體內(nèi)抑制HCC的腫瘤發(fā)生，提示FOXN3在HCC中起著抑癌作用。Li等[13]發(fā)現(xiàn)， FOXN3促進(jìn)體外乳腺癌細(xì)胞的侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)進(jìn)程，以及體內(nèi)乳腺癌的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，表明FOXN3可能是乳腺癌的致癌基因。Chen等[14]發(fā)現(xiàn)，miR-611通過(guò)靶向FOXN3促進(jìn)舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXN3在食管癌細(xì)胞中表達(dá)較低。而過(guò)表達(dá)FOXN3使食管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力減弱，且增殖相關(guān)蛋白Ki-67和侵襲相關(guān)蛋白MMP-2蛋白表達(dá)降低，而細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)升高。表明FOXN3可能在食管癌中起腫瘤抑制作用。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路涉及多種重要的細(xì)胞功能，并可通過(guò)調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖、凋亡和EMT過(guò)程促進(jìn)腫瘤的發(fā)展和復(fù)發(fā)。β-catenin磷酸化被抑制可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)β-catenin積累和核易位，隨后β-catenin作為轉(zhuǎn)錄共激活因子與T細(xì)胞因子(TCF)/淋巴增強(qiáng)因子(LEF1)轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合，激活下游靶基因發(fā)揮功能[15-16]。在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活可以上調(diào)與細(xì)胞增殖和遷移有關(guān)的靶基因，例如c-myc和cyclin D1，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，導(dǎo)致細(xì)胞癌變[17]。魏莉等[18]研究表明，敲減AT富集作用域2(ARID2)基因可促進(jìn)Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移。另外，F(xiàn)OXN3可以通過(guò)Wnt/β-catenin通路影響腫瘤細(xì)胞。Sun等[19]發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin通路能通過(guò)抑制FOXN3表達(dá)，調(diào)節(jié)黑色素瘤的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移，表明FOXN3與β-catenin相互作用，并可調(diào)節(jié)參與Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)的蛋白質(zhì)。Dai等[20]發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌中FOXN3的丟失會(huì)激活β-catenin/TCF信號(hào)傳導(dǎo)并促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移。Zhao等[21]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXN3的過(guò)度表達(dá)抑制甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖、集落形成、遷移和侵襲，并導(dǎo)致β-catenin、c-Myc和cyclin D1表達(dá)水平顯著降低。另外，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活逆轉(zhuǎn)了FOXN3對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的影響。上述研究均表明FOXN3對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)具有抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)FOXN3降低Wnt1和β-catenin的蛋白表達(dá)，抑制了細(xì)胞中Wnt/β-catenin通路的激活，從而抑制食管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并促細(xì)胞凋亡。

綜上所述，過(guò)表達(dá)FOXN3能夠抑制食管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并促細(xì)胞凋亡。這表明FOXN3在食管癌中發(fā)揮了抑制腫瘤活性的作用，可能是通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。這些發(fā)現(xiàn)為潛在的治療策略提供了新的治療選擇。