基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的益母草治療心梗潛在靶點(diǎn)的研究

楊雨微 聶銳 單鑫 陳靜 汪潔 呂志陽(yáng)

摘 要：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法研究益母草治療心梗的作用機(jī)制。采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及技術(shù)平臺(tái)（TCMSP）根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18的條件篩選出益母草中的化學(xué)成分及相關(guān)作用靶點(diǎn)，通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)找出官方基因名稱(chēng)。利用疾病靶點(diǎn)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與心梗相關(guān)的靶點(diǎn)基因。將活性成分所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因和心梗相關(guān)的靶點(diǎn)基因交集，獲得兩者的共同基因即為益母草治療心梗的關(guān)鍵靶點(diǎn)。使用Cytoscape軟件構(gòu)建中藥-活性成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)度值進(jìn)行篩選，尋找益母草治療心梗的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。將關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)獲得蛋白互作關(guān)系，結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行可視化。利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)及ClueGo插件對(duì)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO注釋分析和KEGG通路分析，探究益母草治療心梗的生物過(guò)程及作用通路。

關(guān)鍵詞：益母草；心梗；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；潛在靶點(diǎn)

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81073111，81374029，81874359）；江蘇省自然科學(xué)基金（BK20161371）；江蘇省高校自然基金（18KJB36011）；江蘇省高校自然科學(xué)研究面上項(xiàng)目（18KJB310012）；2019江蘇省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（YB201997）

目前，心梗是導(dǎo)致人類(lèi)死亡的重要原因之一，對(duì)于急性心肌梗死來(lái)說(shuō)，主要治療手段是再灌注，減輕再灌注損傷逐漸成為抗心肌梗死的關(guān)鍵問(wèn)題之一[1]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，中藥在心梗的防治方面有著較好的效果。

益母草[Leonurus artemisia （Laur.） S. Y. Hu F]，為唇形科植物的新鮮或干燥地上部分，味苦、辛，性微寒，歸肝、心包、膀胱經(jīng)，主要功效為清熱解毒、利尿消腫、活血調(diào)經(jīng)。益母草中主要活性成分是鹽酸益母草堿和鹽酸水蘇堿，都能夠增強(qiáng)心血管活性[2]。近30年來(lái)，大量的實(shí)驗(yàn)和臨床研究已經(jīng)證明益母草堿具有溶栓、子宮興奮、降脂、抗凝、抑制血小板的聚集、降低血液黏度、減少紅細(xì)胞聚集、改善微循環(huán)、改變氧自由基等作用，從而為其用于心梗的治療提供了依據(jù)[3]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過(guò)構(gòu)建藥物化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)之間的關(guān)系，從多成分、多靶點(diǎn)的角度闡明其作用機(jī)制。擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選出益母草的化學(xué)成分和作用靶點(diǎn)，同時(shí)檢索疾病相關(guān)靶點(diǎn)，利用用于注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫(kù)（the Database for Annotation， Visualization and Integrated Discovery，DAVID）及ClueGo分析探究益母草治療心梗的潛在作用通路，為臨床治療心梗提供新思路。

1 材料與方法

1.1 益母草活性成分的篩選

采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及技術(shù)平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）篩選益母草中的活性成分。FJHQT作為湯劑，基于類(lèi)藥性（Drug-Like，DL）≥0.18和口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%篩選，收集益母草的活性成分，同時(shí)利用TCMSP和文獻(xiàn)檢索收集其作用靶點(diǎn)。

1.2 構(gòu)建活性成分-作用靶點(diǎn)

將益母草的作用靶點(diǎn)名稱(chēng)標(biāo)準(zhǔn)化，同時(shí)刪除重復(fù)項(xiàng)得到潛在作用靶點(diǎn)。利用Cytoscape軟件構(gòu)建“活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)互作圖。

1.3 心梗靶點(diǎn)的收集

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)和人類(lèi)在線(xiàn)孟德?tīng)栠z傳平臺(tái)（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）上，以“Myocardial infarction”為關(guān)鍵詞，搜索與心梗相關(guān)的疾病作用靶點(diǎn)并刪除重復(fù)項(xiàng)進(jìn)行整合。

1.4 關(guān)鍵作用靶點(diǎn)的確定

將藥物作用靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)交集，從而確認(rèn)益母草治療心梗的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，為后續(xù)進(jìn)一步構(gòu)建蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用（Protein-Protein Interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖提供依據(jù)。

1.5 關(guān)鍵作用靶點(diǎn)構(gòu)建“蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)”相互作用網(wǎng)絡(luò)

String數(shù)據(jù)庫(kù)可用于構(gòu)建“蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)”相互作用關(guān)系，將益母草治療心梗的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇“Multiple Proteins by Names”/“Identifiers”一欄，將Organism設(shè)置為“Homo sapiens”，點(diǎn)擊“search”，將“minimum required interaction score”一欄數(shù)值設(shè)置為大于0.9，點(diǎn)擊update，獲得蛋白互作關(guān)系，將得到的結(jié)果以TSV格式導(dǎo)出。

1.6 關(guān)鍵作用靶點(diǎn)的GO富集及KEGG通路分析

通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析，分析選擇細(xì)胞的組成（Cell Composition，CC）、分子的功能（Molecular Function，MF）和生物的過(guò)程（Biological Process，BP）3個(gè)因素，得到GO富集結(jié)果。利用 Cytoscape中的ClueGo插件對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析，從而得到益母草治療心梗的作用信號(hào)通路。

2 結(jié)果

2.1 益母草活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)信息

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)查詢(xún)到益母草的化學(xué)成分52個(gè)。通過(guò)OB和DL值進(jìn)行篩選得到其活性成分9個(gè)，將其相關(guān)靶點(diǎn)蛋白名記錄于Excel表格中。

2.2 益母草潛在作用靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果及“活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析

通過(guò)TMCSP數(shù)據(jù)庫(kù)收集52個(gè)活性成分的潛在作用靶點(diǎn)，將潛在作用靶點(diǎn)的蛋白名導(dǎo)入，得到對(duì)應(yīng)的官方基因名。將活性成分及331個(gè)潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行可視化，構(gòu)建“活性成分-潛在作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，從而揭示化學(xué)成分與靶點(diǎn)之間的關(guān)系（見(jiàn)圖1）。

2.3 關(guān)鍵作用靶點(diǎn)的蛋白互作關(guān)系

將上述156個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建“蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)”P(pán)PI網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置研究物種為人類(lèi)，在“minimum required interaction score”一欄，將其數(shù)值設(shè)置為大于0.9，點(diǎn)擊“start”，得到蛋白互作關(guān)系。

2.4 關(guān)鍵作用靶點(diǎn)的生物功能預(yù)測(cè)及作用通路分析

通過(guò)Cytoscape軟件中的ClueGo插件對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，其中P<0.05的通路被顯著富集。通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上述關(guān)鍵作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO注釋分析。

3 討論

心肌梗死是一種非常嚴(yán)重的致命性疾病，其總死亡率可達(dá)30%。中藥益母草治療心梗的作用機(jī)制尚不明確，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究益母草治療心梗的潛在作用機(jī)制，避免單靶點(diǎn)的局限，從探索研究多靶點(diǎn)出發(fā)，能夠更加明確益母草治療心梗的主要物質(zhì)基礎(chǔ)及其潛在的作用機(jī)制，為中藥治療心梗提供更多科學(xué)依據(jù)。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法對(duì)益母草進(jìn)行研究，得到益母草9個(gè)入血活性成分，預(yù)測(cè)了331個(gè)潛在作用靶點(diǎn)。在GO富集分析結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要通過(guò)調(diào)控血管生成、血管發(fā)育、血栓形成等環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。在KEGG通路分析結(jié)果中，發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要集中作用在TNF通路、AGEs-RAGE通路和TGF等信號(hào)通路。這些通路主要在炎癥、纖維化和免疫等方面發(fā)揮作用。

4 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)益母草防治心梗的關(guān)鍵靶點(diǎn)及其信號(hào)通路，推測(cè)該藥對(duì)疾病的潛在作用機(jī)制，可能主要參與抗炎、調(diào)節(jié)免疫及纖維化等過(guò)程，為闡明中藥治療心梗的作用機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] WANG W D，WANG W，CHENG L，et al.Protection effects of Yindan xinnaotong and main components on myocardial ischemia reperfusion injury[J].China Journal of Chinese Materia Medica，2014（9）：1690.

[2] CHEN J M.A survey of motherwort research[J].Journal of Shenyang Pharmaceutical University，1991（4）：296-298.

[3] CHEN S R，ZhENG H R，CHEN H Q，et al.Study on the treatment of myocardial ischemia by the motherwort preparation[J].Chinese Critical Care Medicine，2002（1）：19-22.