王冬濱 李璇 夏洪剛 朱德清 孫忠義

肺癌作為世界首要的腫瘤相關(guān)致死疾病，每年約造成170 萬(wàn)患者死亡。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌發(fā)病率的80%～85%，主要包括腺癌和鱗癌。雖然近年來(lái)肺癌的診治水平較前有了顯著的提升，但肺癌的預(yù)后依舊較差，5年生存率較低［1］。

碳酸酐酶1（carbonic anhydrase 1，CA1）屬于碳酸酐酶家族，位于紅細(xì)胞、胃腸道、心臟組織等細(xì)胞胞漿中。CA產(chǎn)生的碳酸氫鹽的跨膜運(yùn)輸對(duì)細(xì)胞的pH調(diào)節(jié)有重要作用，它可逆地催化CO2的水合形成HCO3-，然后迅速與鈣離子結(jié)合形成碳酸鈣。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，CA參與多種癌癥（如NSCLC、惡性血液病、消化道腫瘤、腎癌及腦膠質(zhì)瘤等）的發(fā)生和發(fā)展，且其表達(dá)量與癌癥細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移以及癌癥患者手術(shù)預(yù)后效果及總生存率密切相關(guān)［2］。

因此，本研究檢測(cè)了CA1 在早期NSCLC 患者血清中的表達(dá)水平，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用細(xì)胞模型驗(yàn)證CA1 對(duì)于肺癌細(xì)胞增殖的影響，為評(píng)估CA1 作為新型NSCLC早期腫瘤標(biāo)志物的效果及潛在治療靶點(diǎn)提供相應(yīng)的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象 實(shí)驗(yàn)組納入2017年1月至2019年1月在天津醫(yī)院接受手術(shù)或活檢，并經(jīng)過(guò)兩位病理學(xué)專家進(jìn)行獨(dú)立病理學(xué)檢查證實(shí)的Ⅰ期初治NSCLC患者，共計(jì)76例。入組條件：①取血前未接受化放療等抗腫瘤治療；②如既往有惡性腫瘤，需經(jīng)治療并復(fù)查5年以上，無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移達(dá)到臨床治愈標(biāo)準(zhǔn)。健康對(duì)照組共計(jì)70 例，需經(jīng)體檢證實(shí)無(wú)呼吸系統(tǒng)疾病及其他部位惡性腫瘤，與NSCLC組年齡、性別等基線數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配。

此項(xiàng)研究獲得天津醫(yī)院倫理審查委員會(huì)的批準(zhǔn)。并告知患者標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)?zāi)康募坝猛?，同時(shí)簽署知情同意書。

1.1.2 試劑 Human CA1 PicoKine ELISA Kit 試劑盒購(gòu)自中國(guó)武漢博士德生物工程有限公司，RPIM 1640以及胎牛血清購(gòu)自中國(guó)北京HyClone公司，胰酶細(xì)胞消化液（0.25%）、Western blot 及IP 細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、CCK-8 試劑盒和MTT 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司，RNAiso Plus購(gòu)自中國(guó)寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，M-MLV-Reverse Transcriptase 和Lipofectamine 2000 Transfection Reagent 購(gòu)自美國(guó)Thermo-Fisher Scientific 公司，BrightGreen 2×qPCR Master-Mix-ROX 購(gòu)自加拿大ABM 公司，CA1（ab109755）、Wnt3a（ab219412）、β-catenin（ab184919）抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司。HRP Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）購(gòu)自中國(guó)武漢埃博泰克生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 血液樣本的獲取 取各組研究對(duì)象清晨空腹的肘正中靜脈血（血液經(jīng)過(guò)促凝處理）5 mL（實(shí)驗(yàn)組于手術(shù)或活檢前取血），4℃靜置1 h，經(jīng)離心（1 000×g，10 min）后吸取血清，分裝置于-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)采用中國(guó)武漢博士德生物工程有限公司Human CA1 Pico-Kine ELISA Kit 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞轉(zhuǎn)染 A549、H520、H1299細(xì)胞系購(gòu)自購(gòu)自美國(guó)ATCC。細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，采用含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的RPIM 1640培養(yǎng)基，每2天換液1次。取對(duì)數(shù)期的細(xì)胞放置在六孔板中，細(xì)胞數(shù)量為每孔5×104，待細(xì)胞增至70%時(shí)，應(yīng)用Lipofectamine 2000 Transfection Reagent 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染過(guò)程嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.4 慢病毒包裝及轉(zhuǎn)染 慢病毒包裝由中國(guó)北京合生基因科技有限公司完成，shRNA序列為：GATCC CCATCATTTCTTCTAGTGTAGCCGCTGGTTCAAG，轉(zhuǎn)染步驟遵循產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.5 質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 CA1 及空白質(zhì)粒的設(shè)計(jì)和構(gòu)建由中國(guó)上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司完成。應(yīng)用Lipofectamine 2000 Transfection Reagent 及質(zhì)粒構(gòu)建RFect/DNA 復(fù)合物。取對(duì)數(shù)期的細(xì)胞放置在六孔板中，細(xì)胞數(shù)量為每孔5×104，待細(xì)胞增殖至80%時(shí)，應(yīng)用無(wú)血清的培養(yǎng)基加入構(gòu)建好的復(fù)合物，培養(yǎng)48 h。

將未做質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為NC 組；將轉(zhuǎn)染亂序siRNA 質(zhì)粒的細(xì)胞作為Scramble 組；將轉(zhuǎn)染CA1 siRNA的細(xì)胞作為sh-CA1組；將轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒的細(xì)胞作為Mock-vector 組；將轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)CA1 質(zhì)粒細(xì)胞作為CA1組。

1.2.6 實(shí)時(shí)定量PCR 按照RNAiso Plus試劑說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA。經(jīng)NanodropTM2000 分光光度計(jì)檢測(cè)A260/280 比值，確定RNA 純度及濃度，采用RNA電泳檢測(cè)RNA 完整性。依據(jù)M-MLV-Reverse 逆轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書，進(jìn)行RNA 逆轉(zhuǎn)錄。采用BrightGreen 2×qPCR MasterMix-ROX 在ABI 7500 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)檢測(cè)基因表達(dá)水平。PCR 反應(yīng)條件為50℃2 min；95℃5 min；95℃15 s，60℃40 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因mRNA 表達(dá)水平。每個(gè)樣品采用3 個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。本實(shí)驗(yàn)所采用的引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR引物序列

1.2.7 Western blot 收集3×106個(gè)細(xì)胞，采用Western及IP 細(xì)胞裂解液提取總蛋白后，應(yīng)用BCA 法進(jìn)行蛋白定量，加入SDS-PAGE 蛋白緩沖液，充分混勻后至100℃金屬浴變性。取30 μg 變性后的樣品，80 V 電泳2 h、120 V轉(zhuǎn)膜80 min后，采用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入對(duì)應(yīng)一抗（1:1 000稀釋）4℃過(guò)夜，隔日應(yīng)用TBST洗膜3次，10 min/次。加入二抗室溫孵育1 h后，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液檢測(cè)，采用BIO-RAD Chemi-Doc XRS凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行記錄拍照。

1.2.8 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) CCK-8實(shí)驗(yàn)采用CCK-8試劑盒嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)采用±s表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ⅰ期NSCLC患者血清中CA1表達(dá)水平明顯增高

酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）結(jié)果示：Ⅰ期初治NSCLC患者血清中CA1 濃度為（3.65±2.05）ng/mL，健康對(duì)照組為（1.96±1.15）ng/mL。與健康人血清樣本相比，NSCLC患者血清中CA1含量明顯升高（P＜0.01，圖1、表2）。

圖1 NSCLC患者血清中CA1濃度與健康人血清樣本檢測(cè)結(jié)果

2.2 CA1表達(dá)水平與肺癌細(xì)胞增殖活性呈正相關(guān)

在A549、H520、H1299 細(xì)胞系中，應(yīng)用shRNA 抑制CA1 表達(dá)后，細(xì)胞中CA1 的蛋白質(zhì)和mRNA 表達(dá)水平較NC 組以及Scramble 組顯著降低（均P＜0.01）；過(guò)表達(dá)CA1 組的CA1 蛋白和mRNA 表達(dá)水平遠(yuǎn)顯著高于對(duì)照組Mock-vector（均P＜0.01，圖2，3）。CCK8結(jié)果顯示（圖4）：抑制CA1 表達(dá)后，A549 細(xì)胞的活性為43.09%±7.57%，較NC 組（99.75%±0.5%）和Scramble 組（97.27%±1.24%）顯著降低（均P＜0.01）；敲低CA1 后，H520 細(xì)胞（34.84%±4.95%）和H1299 細(xì)胞（36.41%±5.35%）的增殖活性也較NC 組（100.08%±2.35%，100.03%±1.08%）及Scramble 組（93.6%±4.196%，96.33%±1.28%）顯著降低（均P＜0.01）。同時(shí)，轉(zhuǎn)染CA1 質(zhì)粒的CA1 組中，A549、H520 和H1299的細(xì)胞增殖活性分別為130.86%±11.44%、135.59%±13.65%及123.04%±13.55%，遠(yuǎn)高于對(duì)應(yīng)的Mock-vector 組（92.77%±7.59%、91.68%±4.96%、95.56%±4.12%，均P＜0.01）。

表2 NSCLC患者與健康人血清樣本中CA1濃度

圖2 A549、H520和H1299不同處理組中CA1 mRNA表達(dá)水平

圖3 A549、H520和H1299不同處理組中CA1蛋白表達(dá)水平

圖4 A549、H520和H1299不同處理組的細(xì)胞活性

2.3 CA1對(duì)WNT/β-catenin信號(hào)通路的影響

實(shí)時(shí)定量PCR 及Western blot 結(jié)果顯示（圖5～7）：在A549、H520和H1299細(xì)胞中，應(yīng)用shRNA敲低細(xì)胞中CA1 后，WNT 信號(hào)通路中的Wnt3a 和βcatenin 的mRNA 及蛋白的表達(dá)水平顯著降低（均P＜0.01），而過(guò)表達(dá)CA1 組相較于對(duì)照組Mock-vector，Wnt3a及β-catenin表達(dá)水平顯著升高（均P＜0.01）。

圖5 A549、H520和H1299不同處理組中Wnt3a mRNA表達(dá)水平

圖6 A549、H520和H1299不同處理組中β-catenin mRNA表達(dá)水平

圖7 A549、H520 和H1299 不同處理組中Wnt3a 和β-catenin 蛋白表達(dá)水平

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)Ⅰ期NSCLC 患者血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CA1 在Ⅰ期初治NSCLC 患者血清中表達(dá)水平上調(diào)。為了進(jìn)一步研究CA1在NSCLC疾病進(jìn)展中的作用，采用RNAi技術(shù)干擾A549、H520、H1299細(xì)胞中CA1 的表達(dá)，研究表明：CA1 對(duì)A549、H520、H1299 細(xì)胞的增殖起到了促進(jìn)作用，并且對(duì)WNT/βcatenin信號(hào)通路起到了正向調(diào)節(jié)作用。

肺癌已經(jīng)成為中國(guó)癌癥死因之首，同時(shí)肺癌發(fā)病率及死亡率也呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)［1］。肺癌的早期篩查對(duì)于患者的診斷和治療尤為重要，隨著細(xì)胞分子生物學(xué)和基因?qū)W的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)多種基因突變與NSCLC的發(fā)生及發(fā)展有著密切的關(guān)系，如BRAF V600E、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、程序性死亡受體-配體1（programmed death-ligand 1，PDL1）等［3-5］，這些基因的發(fā)現(xiàn)為NSCLC的治療提供了非常重要的靶點(diǎn)，顯著地提升了患者的生存質(zhì)量和生存率。而對(duì)于NSCLC的診斷和早期篩查，目前依然主要依靠CT和痰液細(xì)胞學(xué)檢查，缺乏特異的分子生物學(xué)標(biāo)記物。有研究指出，NSCLC發(fā)病早期，循環(huán)腫瘤細(xì)胞（ctDNA）、miRNA及DNA甲基化水平會(huì)發(fā)生一定的改變，這些變化指標(biāo)有可能成為腫瘤早期診斷及篩查的生物標(biāo)志物［6-7］。

CA在人體內(nèi)的主要作用為催化二氧化碳和碳酸的化學(xué)反應(yīng),其在肺部、胃腸道、神經(jīng)系統(tǒng)、腎臟等多種臟器中均有表達(dá)［8］。研究表明，CA在腫瘤的生存、增殖、代謝、轉(zhuǎn)移和侵襲過(guò)程中發(fā)揮重要作用，促使CA1成為新的研究熱點(diǎn)［9-13］。本研究通過(guò)對(duì)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CA1 在早期NSCLC 患者血清中明顯增高，提示CA1 有可能成為一種新型的NSCLC 早期篩查的生物標(biāo)志物。

Wnt/β-catenin 信號(hào)通路在腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、上皮至間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）等過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用［14］。在NSCLC發(fā)病過(guò)程中，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路被激活從而導(dǎo)致NSCLC腫瘤病程進(jìn)展加速［15］。β-catenin作為Wnt/β-catenin 信號(hào)通路重要的下游效應(yīng)因子，其可以激活包括c-Myc、cyclin D1、c-Jun 等原癌基因的表達(dá)［16］。本課題研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC 細(xì)胞系A(chǔ)549、H520 及H1299 中，抑制CA1 的表達(dá)，可使Wnt/βcatenin信號(hào)通路中Wnt3a及β-catenin 表達(dá)水平發(fā)生下調(diào)，反之過(guò)表達(dá)CA1 能夠促進(jìn)Wnt3a 及β-catenin表達(dá)。研究結(jié)果提示CA1能夠通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)NSCLC的進(jìn)展進(jìn)行調(diào)節(jié)。

綜上所述，CA1 的表達(dá)與NSCLC 細(xì)胞的增殖速率呈正相關(guān)，提示其在肺癌的發(fā)生和發(fā)展中有促進(jìn)作用。CA1 在NSCLC 中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究，從而更好地印證CA1 能夠作為NSCLC 早期診斷的生物標(biāo)記物及臨床治療的潛在靶點(diǎn)。