孫萍萍 馬茹 王玲玲 蔣茜 高穎 昌紅 李雁

成年患者的肉瘤約占所有新診斷腫瘤的1%，發(fā)病比例為3～6/10 萬［1］，脂肪肉瘤（liposarcoma）是最常見的軟組織肉瘤，約占所有惡性間葉源性腫瘤的20%。2013版WHO軟組織與骨腫瘤分類將脂肪肉瘤分為非典型性脂肪瘤樣腫瘤/高分化脂肪肉瘤（atypical lipomatous tumor/well-differentiated liposarcoma，ALT/WDLPS）、黏液樣脂肪肉瘤（myxoid liposarcoma，MLS）、去分化脂肪肉瘤（dedifferentiated liposarcoma，DDLPS）和多形性脂肪肉瘤（pleomorphic liposarcoma，PLPS）［2］。MLS 常發(fā)生于四肢軀干，圓形細胞脂肪肉瘤是其高級別組織學(xué)形態(tài)，WDLPS 比DDLPS 的病程更緩慢。DDLPS 代表了從高分化到非脂肪性肉瘤的形態(tài)學(xué)進展，表現(xiàn)出組織學(xué)上的異質(zhì)性。本研究收集在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀壇醫(yī)院接受統(tǒng)一治療的患者大樣本資料，探討腹膜后脂肪肉瘤的臨床病理特征與預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

收集首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀壇醫(yī)院2008年1月至2018年1月明確診斷為腹膜后脂肪肉瘤且臨床資料及隨訪資料完整的病例。臨床資料包括：年齡、性別、主要癥狀和體征、手術(shù)方式及術(shù)中情況、病理診斷及生存情況等。生存期起始點為本院手術(shù)日期，終點為隨訪截止日期（2020年1月19日）或死亡日期，剔除失訪病例。將術(shù)前未接受過任何抗腫瘤治療者的病理標本進行FNCLCC 分級。研究方案獲本院倫理委員會批準。

本研究的病理學(xué)資料包括大體病理學(xué)（腫瘤部位、大小、形態(tài)、腫瘤與周圍組織的關(guān)系等）；組織病理學(xué)類型，F(xiàn)NCLLC 分級，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管瘤栓、神經(jīng)侵犯、腫瘤累及周圍組織及臟器情況，Ki-67與P53等免疫組織化學(xué)指標。

1.2 方法

HE染色和免疫組織化學(xué)法檢測：使用3.7%的中性甲醛液固定標本，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片進行HE 染色，免疫組織化學(xué)采用3 μm 切片脫石蠟，在梯度乙醇中再水化，并在檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）中微波處理10 min，使用0.3%H2O2阻斷內(nèi)源過氧化物酶活性，使用標準方案在自動免疫組織化學(xué)染色機中處理組織（美國Biocare Medical 免疫組織化學(xué)儀，EnVision檢測系統(tǒng)）。免疫組織化學(xué)抗體：Ki-67（美國OriGene，克隆號UMAB107）、P53（美國Ori-Gene，克隆號DO7）。所有抗體在室溫下孵育1 h，用二氨基聯(lián)苯胺顯色，并用Mayer蘇木精對比染色。按照說明書設(shè)立陽性對照，PBS 代替一抗作為陰性對照。Ki-67以細胞核中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒而胞質(zhì)不著色定義為陽性，以Ki-67陽性指數(shù)表示。分為Ki-67＜60%和Ki-67≥60%。P53以細胞核中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒而胞質(zhì)不著色定義為陽性，分為P53＜70%和P53≥70%?；蛴嘘栃詢?nèi)對照的情況下表達完全缺失。

MDM2熒光原位雜交（FISH）分子檢測：常規(guī)組織切片脫蠟脫水，進行組織前處理，經(jīng)過MDM2探針（廣州安必平醫(yī)藥科技股份有限公司）變性雜交、依次經(jīng)2×檸檬酸鈉緩沖液和梯度乙醇洗滌，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）復(fù)染后，中性樹脂封片。采用ZeissAX10 熒光顯微鏡，通過DAPI、異硫氰酸熒光素（FITC）與若丹明（RHOD）濾光片油鏡下計數(shù)200 個細胞內(nèi)熒光信號，不計數(shù)重疊細胞。判讀標準4R2G，GSPMDM2/CSP12≥2.0，提示MDM2基因發(fā)生擴增。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用Excel 2019建立數(shù)據(jù)庫，采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析。計量資料符合正態(tài)分布用獨立樣本t檢驗，不符合正態(tài)分布用非參數(shù)檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗、Fisher確切概率法；應(yīng)用受試者工作特征（receiver operating characteristic curve，ROC）曲線設(shè)定年齡、復(fù)發(fā)次數(shù)、腫瘤大小、Ki-67陽性指數(shù)、P53陽性百分比的cutoff值；生存分析采用Kaplan-Meier法、Log-rank檢驗、Cox回歸模型分析獨立預(yù)后指標，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征

共納入114 例腹膜后脂肪肉瘤患者，男59 例（51.8%），女55例（48.2%）；中位年齡52（22～80）歲；均采用手術(shù)治療，其中單純手術(shù)切除66例（57.9%），行腫瘤細胞減滅術(shù)加腹腔熱灌注化療者42例（36.8%），手術(shù)聯(lián)合放療者6例（5.3%）。詳細臨床病理特征見表1。

2.2 病理學(xué)特征

大體病理學(xué)方面，腫瘤大多數(shù)為孤立性包塊，包膜大部分完整，直徑中位數(shù)20（5～45）cm，少部分肉眼可見浸潤周圍組織及實質(zhì)臟器。腫瘤切面呈黃色，可見灰褐色出血、灰黃色壞死繼發(fā)性改變，部分區(qū)域呈灰白色，質(zhì)地韌，部分區(qū)域質(zhì)地堅硬，甚至骨化（圖1A）。

組織病理學(xué)方面，病理分型為ALT/WDLPS 48例（39.0%）、DDLPS 66例（61.0%）。ALT/WDLPS又分三種亞型［3］：ALT亞型、硬化性脂肪肉瘤亞型、炎癥性脂肪肉瘤亞型。ALT 亞型低倍鏡下由成熟的脂肪組織及脂肪母細胞組成，脂肪細胞大小不一，可見纖維組織分隔成大小不等的小葉，纖維間隔內(nèi)可見核深染、外形不規(guī)則的多核樣細胞，可見單泡狀或多泡狀脂肪母細胞（圖1B）。硬化性脂肪肉瘤亞型有致密的膠原纖維化區(qū)域組成，梭形細胞有一定的異型性，少量多泡狀脂肪母細胞。炎癥性脂肪肉瘤亞型在ALT 和硬化性脂肪瘤內(nèi)含有數(shù)量不等的淋巴細胞和漿細胞浸潤，可形成結(jié)節(jié)狀聚集灶或生發(fā)中心。

DDLPS 一般由兩種不同分化成分組成，界限清楚，少數(shù)情況下可見移行現(xiàn)象，腫瘤常圍繞鄰近的實質(zhì)臟器，被浸潤的脂肪組織可類似WDLPS，DDLPS的分化性成分多為WDLPS，去分化成分可以分成高級別（高度惡性）和低級別（低度惡性）兩種，去分化成分為非脂肪源性高級別肉瘤時多呈纖維肉瘤或多形性未分化肉瘤，為低級別時呈侵襲性纖維瘤病樣、黏液纖維肉瘤樣或炎性肌纖維母細胞瘤樣形態(tài)。少數(shù)情況下可出現(xiàn)異源性成分，如橫紋肌肉瘤、平滑肌肉瘤、骨肉瘤（圖1C）、血管肉瘤等。部分病例可見到腦膜上皮樣的漩渦樣結(jié)構(gòu)。DDLPS 的去分化成分為脂肪源性的肉瘤時，常常呈現(xiàn)PLPS 狀態(tài)（圖1D），DDLPS常常出現(xiàn)黏液變性背景（圖1E）。淋巴結(jié)內(nèi)可見WDLPS轉(zhuǎn)移，可見脈管瘤栓及神經(jīng)侵犯。

免疫組織化學(xué)方面，P53陽性百分比＜70%者85例（74.6%），P53陽性百分比≥70%者29例（25.4%）（圖1F）。Ki-67 陽性指數(shù)＜60%者88 例（77.2%），≥60%者26 例（22.8%）。

分子病理學(xué)方面，DDLPS與MLS、PLPS難以鑒別時，應(yīng)用MDM2基因擴增熒光原位雜交（FISH）檢測，脂肪肉瘤腫瘤細胞內(nèi)可出現(xiàn)紅色信號增多，提示MDM2基因發(fā)生擴增（圖1H）。

表1 腹膜后脂肪肉瘤患者的生存單因素分析

表1 腹膜后脂肪肉瘤患者的生存單因素分析（續(xù)表1）

圖1 脂肪肉瘤的大體病理、組織病理及分子病理學(xué)特征

2.3 隨訪及生存情況

114 例患者中位隨訪時間68.9 個月（95%CI：51.4～86.4 個月），中位總生存期（median overall survival，mOS）38.8 個月（95%CI：19.4～58.2 個月），死亡70例（61.4%），生存44例（38.6%）；1、3、5年生存率分別為72.6%、50.5%和36.5%（圖2A）。2.4 生存相關(guān)的單因素及多因素分析

應(yīng)用ROC曲線確定年齡的cutoff值是55歲、核分裂的cutoff 值是3 個/10 高倍視野（HPF）、腫瘤大小的cutoff值是25.5 cm、Ki-67指數(shù)的cutoff值是60%，P53陽性百分比的cutoff值是70%。單因素生存分析顯示以下臨床病理指標與生存有相關(guān)性：組織學(xué)類型、FNCLCC 分級、核分裂、壞死、復(fù)發(fā)、脈管瘤栓、Ki-67陽性指數(shù)、P53陽性百分比（表1）。WDLPS的mOS明顯大于DDLPS（P＜0.001）；FNCLCC 分級中Ⅰ級的mOS明顯大于Ⅱ、Ⅲ級（P＜0.001）；無復(fù)發(fā)患者的mOS明顯大于有復(fù)發(fā)患者（P＜0.001）；核分裂≤3個/10HPF的mOS明顯大于核分裂＞3個/10HPF（P＜0.001）；無壞死的中位mOS 明顯大于有壞死（P＜0.001）；無脈管瘤栓的mOS 明顯大于有脈管瘤栓（P＜0.028）；無骨化成分的mOS 明顯大于有骨化（P＜0.020）；Ki-67 陽性指數(shù)＜60%的mOS 明顯大于≥60%（P=0.049）；P53 陽性百分比＜70%的mOS明顯大于P53≥70%（P=0.014）。

將上述單因素分析有統(tǒng)計學(xué)意義的變量納入COX 比例風險模型進行多因素分析，發(fā)現(xiàn)壞死（HR=1.984，P=0.024）、復(fù)發(fā)（HR=2.161，P=0.049）是腹膜后脂肪肉瘤影響預(yù)后的獨立臨床病理指標（圖2B、圖2C、表2）。

圖2 114例腹膜后脂肪肉瘤多因素分析生存曲線

表2 114例腹膜后脂肪肉瘤與生存相關(guān)病理特征的多因素分析

3 討論

軟組織肉瘤是少見的惡性腫瘤，脂肪肉瘤是最常見的軟組織肉瘤［4］。脂肪肉瘤的復(fù)發(fā)率為30%～60%，高于其它軟組織肉瘤［5］。本院2008～2018年病例中脂肪肉瘤占所有惡性間葉源性腫瘤的36%，腹膜后脂肪肉瘤總復(fù)發(fā)率為78.9%。1、3、5年總生存率分別為72.6%、50.5%和36.5%。主要發(fā)生于50～60 歲中老年，男女均可發(fā)生，無明顯性別差異，雖然腫瘤大小與預(yù)后不相關(guān)，但是＜25.5 cm者比≥25.5 cm者的mOS明顯長（43.8個月vs.24.8個月）。

脂肪肉瘤主要發(fā)生于四肢軀干和腹膜后，其它少見部位有縱隔、胸腔、睪丸旁、精索、食管、子宮［3］等。有的文獻［6］報道腫瘤切面呈多房囊性，本文中脂肪肉瘤有完整的包膜，切面大多數(shù)為實性。本組中腫瘤最大徑約45 cm，比個案報道［7］腫瘤最大徑40 cm略大。本文腹膜后脂肪肉瘤是一種中到高級別的肉瘤，局部復(fù)發(fā)率約78.9%，腫瘤相關(guān)的死亡率約61.4%，均高于文獻中［8］報道，但相比較于其他類型的多形性肉瘤來說，DDLPS的預(yù)后仍然相對較好［9］。

WDPLS與多形性脂肪瘤、棕色瘤鑒別，DDLPS與胃腸道間質(zhì)腫瘤、單相梭形細胞性滑膜肉瘤、多形性未分化肉瘤、惡性外周神經(jīng)鞘瘤、纖維肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤等鑒別。由于脂肪肉瘤均存在12q14-15 區(qū)域的擴增和過表達，而MDM2 蛋白和CDK4 蛋白的強表達與相應(yīng)的基因擴增存在高度的一致性，因此免疫組織化學(xué)染色顯示MDM2 和CDK4共表達（均為彌漫核表達）對于診斷DDLPS具有較大的幫助。P16敏感性高，但特異性較低（圖1G），因而三種抗體聯(lián)合應(yīng)用對診斷脂肪肉瘤有重要意義。除MLS 具有黏液背景外，DDLPS 和WDLPS 也常常伴有黏液變性，尤其是DDLPS黏液變性嚴重時，出現(xiàn)薄壁毛細血管網(wǎng)，呈分枝狀、雞爪樣血管，常常誤診為MLS，應(yīng)該多取材，仔細閱片去尋找黏液變區(qū)域與致密區(qū)域的移行過渡區(qū)（圖1E），一般情況下MLS 主要發(fā)生于四肢軀干，很少發(fā)生于腹膜后，可以用NYESO-1［10］免疫組化抗體加以鑒別。如果確實難以鑒別，應(yīng)結(jié)合病史以除外四肢軀干來源的轉(zhuǎn)移，應(yīng)用FUS-DDIT3 融合基因、MDM2 擴增基因進行FISH 檢測［11］，MLS常出現(xiàn)FUS-DDIT3基因融合，而DDLPS常出現(xiàn)MDM2基因擴增（圖1H）。DDLPS與多形性脂肪肉瘤難以鑒別時，可應(yīng)用MDM2分子檢測鑒別。核分裂＜3 個/10HPF 與≥3 個/10HPF 相比mOS 明顯延長（63.2個月vs.15.3個月）。與無壞死的組織學(xué)形態(tài)相比，有壞死患者的中位OS 明顯降低（19.1 個月vs.69.1個月），具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義。

Gronchi 等［12］報道FNCLCC 分級對腹膜后脂肪肉瘤的預(yù)后有顯著的預(yù)測作用，本文中單因素預(yù)后分析顯示FNCLCC分級與預(yù)后明顯相關(guān)，但多因素預(yù)后分析沒有統(tǒng)計學(xué)意義。在軀干和肢體的軟組織腫瘤中淋巴管血管侵犯似乎是一個明顯的不利病理因素，即使考慮到其他已確定的預(yù)后因素，淋巴管血管侵犯仍預(yù)示生存期較差［13］。雖然本文分析顯示脈管瘤栓與生存預(yù)后有統(tǒng)計學(xué)相關(guān)，但是由于本研究納入脈管瘤栓的患者數(shù)較少，有無脈管瘤栓數(shù)據(jù)差距比較大，結(jié)果具有一定的偏倚，需要納入更多的病例，進一步去探討脈管瘤栓與生存期的關(guān)系。多因素分析顯示預(yù)后最重要的因素是腫瘤壞死和復(fù)發(fā)，但腫瘤大小、核分裂、脈管瘤栓、神經(jīng)侵犯等指標也應(yīng)在治療決策中予以考慮，有助于對臨床試驗患者進行分層。本文中有無伴發(fā)器官切除和是否侵犯臟器對改善患者生存期無統(tǒng)計學(xué)意義，單純手術(shù)治療與是否接受熱灌注治療、放化療對生存期沒有顯著影響，這與文獻報道的結(jié)果一致［8-9，14-15］。因此手術(shù)治療是目前治療脂肪肉瘤最有效的方式。

總之，本研究提示，決定腹膜后脂肪肉瘤預(yù)后最重要的臨床病理因素是腫瘤壞死和復(fù)發(fā)，但這些結(jié)果需要前瞻性研究證實。