四川傳統(tǒng)發(fā)酵香腸中幾株優(yōu)勢乳酸菌的分離鑒定

吉莉莉，陳雪玲，魏艷，付婷婷，何丹，張崟*，趙黎明,2，王衛(wèi)

(1.成都大學肉類加工四川省重點實驗室，成都 610106；2.華東理工大學 發(fā)酵工業(yè)分離提取技術研發(fā)中心，生物反應器工程重點實驗室，上海 200237)

四川傳統(tǒng)發(fā)酵香腸具有獨特的風味，其風味形成過程是在濕度、溫度及環(huán)境微生物等綜合因素作用下，通過發(fā)酵產(chǎn)生獨特風味[1]。該香腸與國外的發(fā)酵香腸不同，口感上不會偏酸，而且更加醇厚，有回香。在四川傳統(tǒng)發(fā)酵香腸制作過程中，乳酸菌是其風味形成的重要菌種[2]。乳酸菌可以利用糖源，發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸等有機酸，使香腸的pH降低，抑制了其他有害菌的生長，使乳酸菌在產(chǎn)品中具有顯著的優(yōu)勢性[3]。因此，在四川傳統(tǒng)發(fā)酵香腸制品中存在著大量乳酸菌。

乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸分子，脫水可縮聚為聚乳酸[4]。聚乳酸是制備生物可降解塑料的重要原料[5]。聚乳酸塑料備受輕工業(yè)界的重視，也是近年來國家重點扶持的新材料種類。在生物醫(yī)學領域[6,7]、工業(yè)和農(nóng)業(yè)領域[8,9]，以及食品包裝中均有應用[10]。如何獲得高效產(chǎn)乳酸分子的乳酸菌，對聚乳酸塑料的工業(yè)制造非常關鍵。為此，為了獲得高效產(chǎn)乳酸菌種，本文以四川傳統(tǒng)發(fā)酵香腸為原料，對其中的乳酸菌進行分離、純化和鑒定，以期為制備生物源乳酸分子提供菌種，并為開發(fā)肉制品發(fā)酵劑及傳統(tǒng)肉制品加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、培養(yǎng)基與試劑

香腸原料肉、輔料(食鹽、香辛料、醪糟、紅曲米、味精等)：購自成都市十陵鎮(zhèn)鑫大百貨。MRS培養(yǎng)基、甘露醇培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、虎紅培養(yǎng)基、PCA培養(yǎng)基：杭州微生物試劑有限公司。GEN Ⅲ 微生物鑒定板、去碳源培養(yǎng)基：美國Biolog公司。Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒、DNA Ladder Mix Marker、通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)：生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 主要儀器與設備

拍打式無菌均質(zhì)器 寧波新芝生物科技股份有限公司；MicroStation微生物鑒定系統(tǒng) 美國Biolog公司；PCR儀 美國Applied Biosystems公司；凝膠成像系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司；冷凍高速離心機 美國BBI公司。

1.3 方法

1.3.1 四川傳統(tǒng)發(fā)酵香腸加工工藝

原料肉→絞肉→混勻(肥肉∶瘦肉為3∶7，加入輔料)→灌腸→冷風干燥10 d→真空包裝。

1.3.2 香腸中菌相分析

香腸風干10 d后，對樣品中的各種微生物進行計數(shù)。在樣品不同部位無菌取樣25 g，剪碎，放入無菌均質(zhì)袋中，加入225 mL無菌生理鹽水于拍打式均質(zhì)器中拍打5 min，10倍倍比稀釋后，選擇合適的稀釋濃度，在不同的培養(yǎng)基平板中進行培養(yǎng)，每個濃度做3個重復，37 ℃，48 h后進行計數(shù)。PDA培養(yǎng)基和虎紅培養(yǎng)基于25 ℃，120 h后進行計數(shù)。

1.3.3 乳酸菌菌株分離純化

觀察記錄MRS培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)，挑取優(yōu)勢菌落單個菌落進行革蘭氏染色，并在MRS平板上劃線純化，直至整個平板和鏡下觀察菌落形態(tài)一致。將已純化的菌株接種斜面于4 ℃，用于平時使用。利用瓷珠保存于-80 ℃，用于長期菌種保存。

1.3.4 菌種的鑒定

1.3.4.1 微生物鑒定系統(tǒng)鑒定

挑取純化的菌落，接種于去碳源平板中，30 ℃培養(yǎng)24 h。用無菌棉簽挑取已去碳源的菌落于IF培養(yǎng)基中，調(diào)整比濁度至98%左右，將IF培養(yǎng)基接種于GEN Ⅲ 微生物鑒定板中，每孔50 μL，置于30 ℃，培養(yǎng)24 h，在微生物鑒定系統(tǒng)中讀取數(shù)據(jù)。

1.3.4.2 分子生物學鑒定

細菌基因組DNA提取：應用細菌基因組提取試劑盒提取細菌DNA，提取產(chǎn)物經(jīng)過PCR擴增，擴增體系：Template 0.5 μL，Buffer 2.5 μL, dNTP 1 μL, 酶0.2 μL，27F 0.5 μL，1492R 0.5 μL， PCR擴增反應條件，94 ℃ 4 min預變性；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s，30 個循環(huán)；72 ℃ 修復延伸10 min，4 ℃終止。PCR產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測序結果與GenBank基因數(shù)據(jù)庫中16S rDNA序列進行同源性比較分析，鑒定出微生物種類。

2 結果與分析

2.1 發(fā)酵香腸中的微生物數(shù)量

為了分析發(fā)酵香腸中的微生物數(shù)量，對其中的主要微生物數(shù)量進行培養(yǎng)計數(shù)，所得結果見圖1。

圖1 樣品中微生物數(shù)量Fig.1 Number of microorganisms in sample

由圖1可知，香腸中含有乳酸菌、微球菌、霉菌和酵母菌，其中乳酸菌為香腸中的優(yōu)勢菌落，數(shù)量為(7.21±0.33)log CFU/g，其次為微球菌。

由于香腸配方中添加了含有微生物的輔料醪糟，其中所自帶的發(fā)酵微生物在香腸中繼續(xù)生長。因此，各種微生物的含量比一般香腸高，但低于添加工業(yè)發(fā)酵劑的發(fā)酵香腸[11,12]。MRS培養(yǎng)基中生長的乳酸菌量較多，這就使乳酸菌的分離更加容易。

2.2 乳酸菌的分離純化

通過對MRS平板中菌落形態(tài)進行觀察，選取了3種形態(tài)有差異的菌落進行分離純化。這3種菌在經(jīng)過反復挑取單個菌落，并在MRS平板中劃線，最終獲得了平板與鏡下形態(tài)一致的菌落。這3種菌平板上的形態(tài)表現(xiàn)出一定的差異，各種菌落的形態(tài)特征描述見表1。

表1 3株菌的形態(tài)特性Table 1 Morphological characteristics of three strains of bacteria

2.3 乳酸菌的微生物鑒定系統(tǒng)鑒定

為了進一步明確所得3株菌的種屬，采用微生物鑒定系統(tǒng)對其進行了鑒定。GENⅢ微孔板使用固定在微孔板上的94個不同的生化試驗來對廣泛的革蘭氏陽性和陰性細菌提供表型概況并進行鑒定，Biolog鑒定系統(tǒng)中的軟件通過讀取GENⅢ微孔板上所表現(xiàn)出來的表型圖譜來對細菌進行鑒定。最終經(jīng)過系統(tǒng)比對，給出最有可能的微生物種類。

3株菌接種GENⅢ 鑒定板24 h后，放置于微生物鑒定系統(tǒng)中進行讀數(shù)鑒定，鑒定板經(jīng)過24 h培養(yǎng)后，對碳源利用后顯色見圖2。

圖2 GENⅢ微孔板24 h表型圖譜Fig.2 24 h phenotypic spectrum of GEN III microporous plate

注：全灰色為陽性，半灰色為弱陽性，白色為陰性。

通過微生物鑒定系統(tǒng)讀數(shù)后分析，1號菌95.3%可能性為糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)，2號菌90.4%可能性為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)，3號菌94.1%可能性為腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)。

2.4 乳酸菌的分子生物學鑒定

為了進一步驗證所得微生物的種屬，對純化得到的3株菌的16S rDNA擴增產(chǎn)物進行電泳分析，電泳后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察拍照，結果見圖3。

圖3 16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳圖 Fig.3 Electropherogram of 16S rDNA PCR products

圖3中DNA的分子量大小數(shù)據(jù)顯示，在約為1500 bp處出現(xiàn)了熒光條帶，將產(chǎn)物送至測序公司測序，將所得到的序列在NCBI上進行BLAST同源性分析，結果見表2。

表2 3株菌的序列分析Table 2 Sequence analysis of three strains of bacteria

經(jīng)過對3株菌的序列測定后，可知1號菌為糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)，2號菌為戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)，3號菌為腸膜明串珠菌，該結果只有2號菌與微生物鑒定系統(tǒng)的結果有差異，另外兩株結果一致。由結果可知，生理生化鑒定在一定程度上與分子生物學鑒定保持一致，在實驗室可作為微生物鑒定中的輔助方法。

糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)是一種典型的乳酸菌，常被用于制作奶酪等乳制品，具有提高奶酪感官特性的作用[13]，也常在發(fā)酵香腸中被分離到[14]。這種菌株若攜帶耐藥基因，隨著飲食進入人體，會通過水平轉移傳遞給其他腸道基因[15]。目前已有研究人員將耐藥性低、生物胺產(chǎn)量少的糞腸球菌應用于發(fā)酵香腸的制作，所制作出的香腸，感官上沒有顯著的變化，但是干燥結束后腸桿菌、金黃色葡萄球菌和革蘭氏陽性菌含量降低，對單增李斯特菌產(chǎn)生抑制作用，為發(fā)酵香腸的生物保存的提供了一種有益菌[16]。因此，在保證安全性前提下，糞腸球菌對發(fā)酵香腸的保存具有積極作用。

戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)是發(fā)酵肉制品中常見的乳酸菌[17，18]，對發(fā)酵香腸中的蛋白水解有一定影響[19]。含有戊糖片球菌作為發(fā)酵劑的香腸，可增加萜類及含硫類風味物質(zhì)[20，21]。腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)是乳酸菌中明串珠菌屬的重要菌種，能發(fā)酵糖類產(chǎn)生多種酸和醇，具有高產(chǎn)酸能力、抗氧化能力和拮抗致病菌等能力。一般在發(fā)酵乳制品、青貯、泡菜、果酒中[22]，在發(fā)酵肉制品中的報道還不多見。腸膜明串珠菌屬于異形發(fā)酵乳酸菌，只將50%的糖轉化成乳酸，其余的糖則轉變成酒精、醋酸及二氧化碳。在某些微生物酶的作用下，有些糖會被聚合成多糖，使香腸形成良好的風味[23]。由研究結果可知，這3株乳酸菌在香腸的風味、色澤、安全性、貯存性等方面均具有積極的作用，具有一定的應用價值。

3 結論

通過對四川傳統(tǒng)香腸中幾株乳酸菌的分離、純化，結合微生物鑒定系統(tǒng)進行生理生化鑒定及16S rDNA分子生物學鑒定，得到了糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)和腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)3種乳酸菌。這3株乳酸菌在傳統(tǒng)香腸中均具有產(chǎn)生乳酸，降低產(chǎn)品pH值的作用，對于產(chǎn)品的發(fā)色、風味及亞硝酸鹽等有積極的作用。因此，四川傳統(tǒng)香腸的品質(zhì)、質(zhì)量及安全性與其中所含有的乳酸菌有著密不可分的關系。該研究中所分離得到的3種乳酸菌，為制備生物源乳酸單體提供了菌種，并為開發(fā)肉制品發(fā)酵劑及傳統(tǒng)肉制品加工提供了參考。