(1.湖南省腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南省胃癌研究中心，南華大學(xué)腫瘤研究所，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.株洲市中心醫(yī)院腫瘤科,湖南 株洲 412007)

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，據(jù)2018年報(bào)告，全球每年新發(fā)病例約100萬(wàn)，死亡78.3萬(wàn)，發(fā)生率與死亡率分別居于第五位與第三位[1]。我國(guó)是胃癌高發(fā)地區(qū)，發(fā)生率與死亡率僅次于肺癌而位于第二。由于胃癌患者就診時(shí)大多已經(jīng)發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移，治療效果較差[2-3]。從而，探討胃癌侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制與治療靶點(diǎn)是非常關(guān)鍵的問題。

LIM激酶(LIM kinase, LIMK)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，LIMK家族有兩個(gè)成員，即LIMK1和LIMK2。LIMK通過磷酸化和失活肌動(dòng)蛋白解聚因子調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白聚合，調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、侵襲轉(zhuǎn)移等功能[4]。研究顯示，LIMK1在胃癌中高表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)。沉默LIMK1可抑制細(xì)胞增殖與遷移侵襲，并且，體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)和腹膜轉(zhuǎn)移，表明lIMK1可用作胃癌治療的潛在靶點(diǎn)[5]。課題組人員前期工作證明，LIMK1在結(jié)腸癌中高表達(dá)，與腫瘤分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及不良預(yù)后密切相關(guān)[6]。本研究采用miR干擾技術(shù)沉默LIMK1基因后，探討其對(duì)人胃癌MGC803細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期與遷移侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人胃癌MGC803細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，于含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，37 ℃，5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。

1.2 主要試劑

LIMK1(ab39641)與β-actin(ab3280)抗體(Abcam公司)。Total RNA Kit(Omega公司)，RT reagent kit(TaKaRa公司)，PCR試劑盒(Promega公司)。BCA蛋白定量試劑盒(美國(guó)Pierce公司)，ECL發(fā)光檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，pcDNATM6.2-GW/EmGFpmiR干擾質(zhì)粒、LipofectamineTM2000、殺稻瘟菌素(invitrogen公司)。質(zhì)粒抽提試劑盒與壯觀霉素(Sigma公司)。Transwell小室(Corning公司)，Matrigel(BD公司)。小牛血清(杭州四季青生物工程公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco公司)。

1.3 構(gòu)建穩(wěn)定LIMK1基因沉默的MGC803細(xì)胞

1.3.1 構(gòu)建miR-LIMK1干擾質(zhì)粒 根據(jù)LIMK1(Genebank accession number：NM_002314.2)基因序列設(shè)計(jì)并合成4對(duì)miRNA oligomers，構(gòu)建pcDNATM6.2-GW/EmGFpmiR-LIMK1干擾質(zhì)粒，miRNA oligomers設(shè)計(jì)、干擾質(zhì)粒構(gòu)建和測(cè)序由invitrogen公司完成。見表1。

表1 miRNA oligomers序列

1.3.2 抽提重組質(zhì)粒 在LB固體培養(yǎng)基上(加壯觀霉素50 μg/mL)劃菌，用10 μm Tip頭挑選單個(gè)散在的菌落，洗脫于4～5 mL的含壯觀霉素50 μg/mL的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫、轉(zhuǎn)速為220-235，轉(zhuǎn)搖菌14-16 h。根據(jù)質(zhì)粒抽提試劑盒步驟提取質(zhì)粒。

1.3.3 LIMK1-miRNA/MGC803轉(zhuǎn)染株的篩選 人胃癌MGC803細(xì)胞1×105/mL接種于24孔培養(yǎng)板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)24 h。將0.8 μg的質(zhì)粒(4個(gè)miR-LIMK1干擾質(zhì)粒與陰性干擾質(zhì)粒)加入無(wú)血清opti-MEM培養(yǎng)基中，最終體積為50 μm(A液)。取2 μm LipofectamineTM2 000加入48 μm無(wú)血清opti-MEM的EP管內(nèi)，輕輕搖勻，放置3～5 min(B液)。將A液與B液混勻，得混合液C，放置20 min。培養(yǎng)箱中取出24孔培養(yǎng)板，棄去培養(yǎng)液，PBS洗2-3次，opti-MEM培養(yǎng)液洗2-3次，加入400 μm的無(wú)血清opti-MEM培養(yǎng)液。將100 μm混合液C加到24孔培養(yǎng)板孔內(nèi)，輕搖培養(yǎng)板使之混勻。將培養(yǎng)板放回37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～6 h，將無(wú)血清opti-MEM培養(yǎng)液更換為10%胎牛opti-MEM培養(yǎng)液。48 h后將24孔培養(yǎng)板孔內(nèi)細(xì)胞以1∶10比例傳代。24 h后換成2.5 μm殺稻瘟菌素+500 μm培養(yǎng)基/每孔，篩選陽(yáng)性克隆，每3天換液一次，2周后可見陽(yáng)性克隆，倒置熒光顯微鏡下觀察，可見細(xì)胞發(fā)綠色熒光。10 μm Tip頭挑取綠色熒光的陽(yáng)性單克隆細(xì)胞至24孔板，待形成陽(yáng)性單克隆細(xì)胞后再挑取至24孔板，反復(fù)3-4次，最后移入培養(yǎng)瓶培養(yǎng)并凍存。

1.4 RT-PCR

RNA試劑盒提取細(xì)胞總RNA，AMV酶作用下逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。見表2。PCR反應(yīng)條件：94 ℃，5 min；94 ℃，40 s，Tm，45 s，72 ℃ 1 min 20 s，28個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。5 μL的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖電泳，溴化乙錠染色，IS1000圖像分析軟件讀取條帶灰度值，相對(duì)值以LIMK1與β-actin灰度值之比表示。

表2 PCR引物序列

1.5 Western Blot

收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，每組取等量樣本進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，加一抗，4 ℃過夜，TBST洗膜，加二抗孵育1 h，洗膜，采用ECL發(fā)光法，最后X片曝光、顯影、定影。

1.6 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組MGC803細(xì)胞，接種到96孔板，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞貼壁4～6 h后進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)；更換細(xì)胞培養(yǎng)基為150 μL RPMI-1640完全細(xì)胞培養(yǎng)基，加20 μL 5 mg/mL MTT溶液，培養(yǎng)4 h；終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，加150 μL DMSO溶液，搖床上常溫平搖10～15 min，使結(jié)晶物充分溶解，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量各孔在OD570nm處的吸光值；最后計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)組OD570值/對(duì)照組OD570)×100%。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組MGC803細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS吹打重懸，離心沉淀，重復(fù)一次。4 ℃預(yù)冷的75%乙醇固定細(xì)胞，冰盒送檢。樣本上機(jī)前離心洗滌，棄上清，加1 g/L碘化丙啶50 μL，振蕩混勻，避光置冰箱30 min，上機(jī)檢測(cè)時(shí)300目尼龍網(wǎng)濾過，計(jì)數(shù)10 000個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.8 劃痕實(shí)驗(yàn)

調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，吸1 mL細(xì)胞懸液接種于6孔板，每組3個(gè)平行樣本。RPMI 1640培養(yǎng)液37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，直至形成細(xì)胞單層。用10 μL Eppendorf Tip在細(xì)胞板上劃痕，無(wú)血清培養(yǎng)液洗3次，加新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)基。顯微鏡下測(cè)量劃痕區(qū)相對(duì)距離，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 侵襲實(shí)驗(yàn)

將基質(zhì)膠稀釋液鋪置在Transwell小室中，100 μL細(xì)胞接種至小室上腔，取500 μL含10%胎牛血清培養(yǎng)液添加至下腔，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)36 h后取出，擦棄小室上層細(xì)胞并用4%多聚甲醛固定10 min，0.1%結(jié)晶祡染色，PBS液洗滌，晾干。顯微鏡下隨機(jī)選取4個(gè)高倍視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取平均值。每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，所得數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，組間區(qū)別用t檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 LIMK1 pcDNATM 6.2-GW/EmGFP-miR質(zhì)粒構(gòu)建、抽提與篩選轉(zhuǎn)染

構(gòu)建人LIMK1-microRNA重組質(zhì)粒pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR，測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)序列完全相符(圖1A)。negative-miR與LIMK1-miR 1-4質(zhì)粒載體的甘油菌液中提取質(zhì)粒，4 μL 1%瓊脂糖凝膠電泳(圖1B)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MGC803細(xì)胞24 h后，倒置熒光顯微鏡可見綠色熒光。加殺稻瘟菌素篩選2周后，可見陽(yáng)性克隆細(xì)胞(圖1C)，挑選克隆細(xì)胞加低劑量殺稻瘟菌素繼續(xù)培養(yǎng)(圖1D)。

2.2 RT-PCR與Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后LIMK1 mRNA與蛋白的變化

圖2顯示，轉(zhuǎn)染LIMK1-miR后，LIMK1 mRNA表達(dá)明顯下降，并以LIMK1-miR 4干擾效率最好(P<0.05)。LIMK1-miR1-4細(xì)胞較未轉(zhuǎn)染組LIMK1表達(dá)分別下降30%、28%、72%、75%，LIMK1-miR4組最明顯(P<0.05)，陰性轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組間差異無(wú)顯著性(P>0.05)。根據(jù)RT-PCR與Western blot結(jié)果，LIMK1-miR4細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 穩(wěn)定低表達(dá)LIMK1基因細(xì)胞系的建立A:重組質(zhì)粒測(cè)序圖; B:干擾質(zhì)粒的抽提.0:negative-miR;1:LIMK1-miR 4; 2:LIMK1-miR 3; 3:LIMK1-miR 2;4:LIMK1-miR 1; C:熒光顯微鏡檢測(cè)殺稻瘟菌素篩選后的陽(yáng)性細(xì)胞克隆; D:熒光顯微鏡檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞克隆擴(kuò)增培養(yǎng)

圖2 RT-PCR與Western blot檢測(cè)各組LIMK1 mRNA與蛋白的表達(dá)情況A:RT-PCR; B: Western blot. M: mark; 1:MGC803; 2: negative-miR; 3: LIMK1-miR1; 4: LIMK1-miR2; 5: LIMK1-miR3; 6: LIMK1-miR4與MGC803和Vector比較，*P<0.05;與LIMK1-miR1和LIMK1-miR2比較，**P<0.05

2.3 沉默LIMK1對(duì)MGC803細(xì)胞增殖及周期的影響

表3所示，LIMK1沉默組細(xì)胞在24、48、72、96 h分別較對(duì)照組與空載體組的抑制率為61.0%、36.9%、12.1%、1.6%和54.7%、46.2%、13.5%、1.5%(P<0.05)。表明沉默LIMK1可呈時(shí)間依賴性抑制MGC803細(xì)胞增殖。圖3與表4所示，LIMK1沉默組G2/M期17.96%明顯高于MGC803組11.45%和空載體組11.68%(P<0.05)。表明沉默LIMK1可阻滯MGC803細(xì)胞G2/M期的作用。

表3 沉默LIMK1對(duì)MGC803細(xì)胞增殖活性的影響 (OD570值)

與MGC803和Vector比較，aP<0.05

圖3 沉默LIMK1對(duì)MGC803細(xì)胞周期的影響A:MGC803; B:Vector; C:miR-LIMK1

表4 沉默LIMK1對(duì)MGC803細(xì)胞周期的影響

與MGC803和Vector比較，aP<0.05

2.4 沉默LIMK1對(duì)MGC803細(xì)胞遷移的影響

圖4顯示，0 h時(shí)，各組劃痕距離大體相同。24h后，未干擾組與陰性干擾組明顯變窄(P<0.05)。干擾組劃痕距離較未干擾組與陰性干擾組明顯增寬(P<0.05)。表明沉默LIMK1可抑制MGC803細(xì)胞遷移。

圖4 沉默LIMK1對(duì)MGC803細(xì)胞遷移的影響(10×)1:MGC803;2:Vector;3:LIMK1-miR.與0 h比較,*P<0.05;與MGC803和Vector 24 h比較，#P<0.05

圖5 沉默LIMK1對(duì)MGC803細(xì)胞侵襲的影響(20×)1:MGC803;2:Vector;3:LIMK1-miR與MGC803和Vector比較，*P<0.05

2.5 沉默LIMK1對(duì)MGC803細(xì)胞侵襲的影響

圖5顯示，24 h后，沉默組穿膜細(xì)胞較未干擾組與陰性干擾組明顯減少(P<0.05)。表明沉默LIMK1可抑制MGC803細(xì)胞侵襲。

3 討 論

大量研究表明，LIMK1在結(jié)腸癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌與食管癌等腫瘤中高表達(dá)與遷移侵襲有關(guān)[4-11]。有人發(fā)現(xiàn)，LIMK1和LIMK2表達(dá)不平衡在結(jié)直腸癌(CRC)進(jìn)展中起重要作用，LIMK2隨著腫瘤從癌前病變向晚期CRC的進(jìn)展而逐漸下調(diào)，阻滯G1-S細(xì)胞周期抑制細(xì)胞增殖，并限制EMT抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移的能力。相反，LIMK2表達(dá)減少可增強(qiáng)核β-catenin積累和激活Wnt信號(hào)通路，促進(jìn)EMT。而LIMK1自始至終在CRC進(jìn)展中高表達(dá)，擔(dān)任LIMK2通過β-catenin核易位的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。因此，LIMK1和LIMK2兩者的聯(lián)合作用為CRC進(jìn)展機(jī)制與抗癌治療的研究提供了新的認(rèn)識(shí)[4]。LIMK1在細(xì)胞漿和核高表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后不良密切相關(guān)。增強(qiáng)LIMK1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核表達(dá)可促進(jìn)EMT與激活PI3K/Akt信號(hào)通路，顯著增加細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)移植瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，而沉默LIMK1效果相反。表明LIMK1在亞細(xì)胞水平上促進(jìn)CRC的進(jìn)展起著關(guān)鍵作用[7]。在PC-3和DU145人前列腺癌細(xì)胞中，ROCK通過靶向LIMK1和MMP-2促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移，而敲除ROCK可下調(diào)p-LIMK1和MMP-2，減少細(xì)胞遷移和侵襲[9]。

近年來，發(fā)現(xiàn)一些miRNAs的靶基因是LIMK1，在抑制腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移中起著重要作用。如LIMK1是miR-128-3p的直接靶基因，miR-128-3p可通過下調(diào)LIMK1/Cofilin1通路抑制乳腺癌的進(jìn)展[8]。LIMK1是miR-138的直接靶點(diǎn)。miR-138可通過靶向LIMK1/cofilin信號(hào)通路抑制NSCLC細(xì)胞的遷移和侵襲。因此，miR-138/LIMK1/cofilin可能是治療NSCLC的潛在治療靶點(diǎn)[10]。在口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)組織和細(xì)胞系中，miR-106a水平顯著下降，LIMK1表達(dá)顯著增加。miR-106a可直接靶向LIMK1抑制OSCC細(xì)胞的增殖和EMT[11]。基于微陣列的基因表達(dá)譜顯示，miR-384和Bax在食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)中表達(dá)較低，而LIMK1、cofilin和Bcl-2在ESCC中表達(dá)較高。miR-384靶向并下調(diào)LIMK1阻斷LIMK1/cofilin通路，抑制細(xì)胞增殖、侵襲、細(xì)胞周期、LNM和腫瘤生長(zhǎng)，促進(jìn)ESCC細(xì)胞凋亡，最終抑制ESCC的發(fā)生發(fā)展[12]。

本研究結(jié)果顯示，采用RNA干擾技術(shù)成功構(gòu)建穩(wěn)定沉默LIMK1基因的MGC803細(xì)胞，并且發(fā)現(xiàn)沉默LIMK1可呈時(shí)間依賴性抑制MGC803細(xì)胞增殖，阻滯G2/M期，抑制細(xì)胞遷移與侵襲。

目前，研發(fā)抑制LIMK1的有效抑制劑和小分子化合物成為抗腫瘤治療的新途徑。研究發(fā)現(xiàn)，小分子化合物L(fēng)C-0882可通過阻斷PAK4/LIMK1/cofilin信號(hào)通路顯著抑制人胃癌細(xì)胞的增殖與侵襲，因此，新型化合物L(fēng)C-0882可能為胃癌治療提供一種新的化療途徑[13]。從草藥分離出來的曲霉醇(Curcolonol，CCL)可降低LIMK1的活性和cofilin 1磷酸化抑制乳腺癌細(xì)胞遷移與F-actin聚合，沉默LIMK1可增強(qiáng)CCL的抑制作用[14]。低納米級(jí)的LIMK1和LIMK2抑制劑通過下調(diào)p-cofilin抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲[15]。氧化苦參堿可下調(diào)p-LIMK1和p-Cofilin抑制人胃癌細(xì)胞遷移和侵襲[16]。在三種倍半萜烯中，絲蘭內(nèi)酯可顯著抑制LIMK1表達(dá)、cofilin1磷酸化、F-actin聚合和增殖與遷移[17]。

課題組成員前期工作證明，LIMK1與ADF分別在結(jié)腸癌中高表達(dá)，與腫瘤分化程度、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及不良預(yù)后密切相關(guān)[6]。此外，發(fā)現(xiàn)二烯丙基二硫(Diallyl disulfide，DADS)可通過下調(diào)LIMK1-ADF/cofilin通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞遷移與侵襲和移植瘤生長(zhǎng)[6,18]。并且，DADS可通過下調(diào)TGFβ1、Rac1、βcatenin、Vimentin和上調(diào)E-cadherin抑制胃癌細(xì)胞EMT以及移植瘤形成[19]。然而，DADS是否可阻斷LIMK1/cofilin通路抑制胃癌細(xì)胞遷移侵襲，尚待進(jìn)一步研究。