張岱陽，李 拓2*，羅 政，尹 銳，胡 睿

(恩施土家族、苗族自治州中心醫(yī)院 1.脊柱外科，2.眼科，湖北 恩施 445000)

強直性脊柱炎是一種主要侵犯脊柱、累及骰骼關(guān)節(jié)的慢性自身免疫炎癥性疾病，以骶髂關(guān)節(jié)和脊柱附著點、中軸骨骼炎癥為主要癥狀，患者致殘率高，對生活質(zhì)量造成嚴重影響[1-2]。該病發(fā)病隱匿，病因較為復雜，多認為與遺傳、感染、免疫、炎性細胞浸潤、細胞因子失衡等因素相關(guān)[3]。研究表明[4]Th17可參與調(diào)控機體免疫平衡且在多種自身免疫疾病發(fā)生及進展過程中起重要作用。果蠅Zesle基因增強子2(enhancer of zesle homolog2，EZH2)是一種重要的組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶，其可催化組蛋白H3上27位的賴氨酸三甲基化(H3K27me3)而抑制靶基因表達[5]。研究發(fā)現(xiàn)[6]EZH2介導的H3K27me3在輔助性T細胞17(T helper cell 17，Th17)分化過程中扮演重要角色。但EZH2在強直性脊柱炎患者中的表達及與Th17分化的關(guān)系尚不清楚。本研究通過檢測EZH2在強直性脊柱炎患者外周血中表達水平并探討其與Th17分化的關(guān)系，以期為強直性脊柱炎的防治提供新的方向，現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2018年6月至2019年6月本院收治的強直性脊柱炎患者84例為病例組，男46例，女38例；年齡22～70歲，平均年齡(36.27±5.56)歲；病程1～8年，平均病程(3.61±1.70)年。納入標準：①符合強直性脊柱炎診斷標準[1]；②無脊柱炎病史或認知功能障礙；③入院資料齊全；④心、肝、腎、肺功能正常；⑤所有入選者對本研究內(nèi)容知情同意。排除標準：①合并惡性腫瘤或先天性心臟瓣膜發(fā)育異常；②合并過敏性疾病或自身免疫性疾??；③納入研究前3個月進行過免疫調(diào)節(jié)治療；④妊娠期、哺乳期女性；⑤合并其他風濕性疾病；⑥合并心腦血管疾病。另選同期在本院健康體檢者50例為對照組，男27例，女13例；年齡21～68歲，平均年齡(35.12±5.68)歲。兩組年齡、性別等基線資料比較，差異無顯著性(P>0.05)(表1)。研究過程遵循人體試驗委員會制定的倫理學標準。

表1 兩組基線資料

1.2 研究方法

1.2.1 外周血單個核細胞中EZH2 mRNA水平 采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(Real time fluorescence quantitative-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)檢測，方法如下：采集兩組受試者空腹外周靜脈血2 mL，置于EDTA抗凝管(山東奧賽特醫(yī)療器械有限公司)中，采用人淋巴細胞分離液(北京冬璞泰和科技有限責任公司)分離外周血單個核細胞，采用總RNA提取試劑盒(上海玉博生物科技有限公司)提取總RNA，總RNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司)操作步驟合成cDNA，以此cDNA為模板行PCR擴增，根據(jù)擴增曲線讀取循環(huán)數(shù)(Ct)，基因的相對表達量=2-△△Ct。

1.2.2 Th17細胞比率測定 采用流式細胞術(shù)檢測，方法如下：采集兩組受試者空腹外周靜脈血2 mL，置于肝素鈉抗凝管中，分離并提純外周血單個核細胞，將其接種于6孔板中(1×106/mL)，加入佛波醇乙酯(北京依托華茂生物科技有限公司)25 ng/mL 2 μL，離子霉素(上海聯(lián)碩生物科技有限公司)1 μg/mL 10 μL，放入37 ℃無菌細胞培養(yǎng)箱(德國Binder公司)中培養(yǎng)1 h，向培養(yǎng)箱中加入1 μL高爾基阻斷劑(上海懋康生物科技有限公司)培養(yǎng)6 h后收集細胞，采用5 μL IL-17A PE(蘇州派普泰克生物科技有限公司)標記Th17細胞，采用NovoCyte流式細胞儀(杭州艾森生物有限公司)檢測Th17細胞百分率，檢測結(jié)果以陽性細胞百分數(shù)表示。

1.2.3 檢測方法 血清白細胞介素1(Interleukin 1，IL-1)、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)、IL-17、IL-23水平：采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測，方法如下：采集兩組受試者空腹外周靜脈血2 mL，3 000 r/min離心15 min，分離血清，采用IL-6檢測試劑盒(武漢默沙克生物科技公司)測定血清IL-6水平，采用IL-17檢測試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)測定血清IL-17水平，采用IL-23檢測試劑盒(上海信然生物技術(shù)有限公司)測定血清IL-23水平，采用TGF-β檢測試劑盒(上海博湖生物科技發(fā)展有限公司)測定血清TGF-β水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結(jié) 果

2.1 兩組外周血單個核細胞中EZH2 mRNA水平

病例組外周血單個核細胞中EZH2 mRNA水平明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表2)。

表2 兩組外周血單個核細胞中EZH2 mRNA水平

2.2 兩組Th17細胞比率

病例組Th17細胞比率明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表3)。

表3 兩組Th17細胞比率

2.3 兩組Th17相關(guān)細胞因子水平

病例組血清IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β水平明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05，表4)。

表4 兩組Th17相關(guān)細胞因子水平 (pg/mL)

2.4 強直性脊柱炎患者外周血中EZH2與Th17、IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β的相關(guān)性

強直性脊柱炎患者外周血中EZH2分別與Th17、IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β呈正相關(guān)(P<0.05，表5)。

表5 EZH2與Th17、IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β的相關(guān)性

3 討 論

強直性脊柱炎(spondylitis ankylosans，AS)是一種自身免疫性疾病，其特征是炎癥高度活動和低度活動相互交替[7]。研究認為[8]該病的發(fā)生與Th17細胞免疫功能異常有關(guān)。Th17是由TH0細胞在TGF-β、IL-6、IL-23等刺激誘導下分化而成的輔助性T細胞，IL-17為其最主要的分泌產(chǎn)物，參與機體防御調(diào)節(jié)[9]。本研究顯示病例組外周血中Th17細胞比率、TGF-β、IL-6、IL-23高于對照組，提示AS發(fā)生可能與Th17細胞分化有關(guān)。其原因可能是Th17激活免疫細胞產(chǎn)生細胞黏附分子，促進血管上皮細胞分泌IL-17、IL-22等炎癥因子，引導炎癥反應。TGF-β、IL-6、IL-23作為誘導Th17細胞分化的關(guān)鍵性細胞因子，在炎癥加劇時其分泌也大量增加[10]。

近年來表觀遺傳學已被報道在免疫應答過程中發(fā)揮作用[11]。組蛋白甲基化修飾是表觀遺傳的調(diào)控方式之一，其修飾功能主要依賴于組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶[12]。EZH2是一種重要的組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶，也是多梳抑制復合體2的催化亞基，能夠催化H3K27me3，使得染色質(zhì)抑制蛋白復合體在靶基因特定位點募集，從而抑制靶基因表達[13]。EZH2與H3K27me3能夠抑制Treg細胞分化[14]，并能夠直接結(jié)合Th2細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Gata3和Th1細胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Tbx21的特定位點抑制2個基因表達，從而抑制CD4+T細胞向Th1、Th2細胞分化[15]。本研究顯示病例組外周血單個核細胞中EZH2 mRNA水平高于對照組，提示EZH2在AS患者外周血中呈高表達。有研究發(fā)現(xiàn)EZH2介導的H3K27me3與Th17分化過程密切相關(guān)，這與本研究相符，本研究顯示AS患者外周血中EZH2與Th17、IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β均呈正相關(guān)，提示EZH2與Th17分化相關(guān)，EZH2可能通過刺激Th17細胞分化，促進自身抗體形成，參與AS發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，EZH2在AS患者外周血中呈高表達且與Th17分化呈正相關(guān)。EZH2可能通過刺激Th17細胞分化，參與AS發(fā)生發(fā)展，這可能為AS的免疫治療提供新的靶點和途徑。本研究為單中心研究，樣本量較少，僅對入院時AS患者外周血中EZH2、Th17、IL-6、IL-17、IL-23、TGF-β水平進行了探討，缺乏動態(tài)觀察，仍需擴大樣本量進一步研究。