邢曉軻

(許昌職業(yè)技術(shù)學(xué)院 園林與食品工程學(xué)院，河南 許昌 461000)

0 引言

曲是糧食或糧食加工副產(chǎn)品時(shí)通過(guò)培養(yǎng)微生物制成的一種含有大量活菌體及其酶類(lèi)的發(fā)酵劑。酒曲是釀酒生產(chǎn)過(guò)程中糖化、發(fā)酵、酒化和生香等工藝所用的試劑，其品質(zhì)對(duì)出酒率和酒質(zhì)有極大影響[1]。如果麩曲在釀造過(guò)程中不被分解利用，其殘?jiān)鼤?huì)污染環(huán)境[2]。為了降低成本，減少環(huán)境污染，應(yīng)用純種微生物來(lái)制取麩皮曲就成為研究熱點(diǎn)。

麩皮是小麥面粉廠的主要加工副產(chǎn)品，含有豐富的淀粉酶系、蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素和礦物質(zhì)等，每年產(chǎn)量可達(dá)2億 t以上，但大多數(shù)都沒(méi)有進(jìn)行深加工和利用，麩皮中的各種營(yíng)養(yǎng)成分有助于微生物及大曲中根霉的生長(zhǎng)。因此，以麩皮為主要原料，蒸熟后接入純種霉菌，可以在人工控溫條件下培養(yǎng)麩皮曲且麩皮曲不論生料或熟料的酶活性都遠(yuǎn)高于其他原料。常采用經(jīng)蒸煮滅菌后接入曲種熟料的方法制得麩皮曲，該方法具有糖化發(fā)酵力強(qiáng)、原料利用率高、生產(chǎn)周期短等特點(diǎn)[3]。與純種霉菌制成的麩皮曲相比，采用混合麩皮曲釀酒能顯著改善酒的品質(zhì)[4]。為了提高麩皮曲中酶的活力，本文利用響應(yīng)面法對(duì)麩皮曲的配方進(jìn)行優(yōu)化，為麩皮曲的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麩皮、稻殼：市售。馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基、蛋白胨購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。磷酸二氫鉀、硫酸鎂、葡萄糖、可溶性淀粉、磷酸二氫鈉、3,5—二硝基水楊酸均為分析純，購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

YP30002電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司；T6新悅可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DK-8D電熱恒溫水浴鍋，常州普天儀器制造有限公司；LDZX-75KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海審安醫(yī)療器械廠；SPX-25-Z恒溫培養(yǎng)箱，上海博泰試驗(yàn)設(shè)備有限公司；JBZL-D8恒溫振蕩培養(yǎng)箱，常州普天儀器制造有限公司；SW-CJ-2FD凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備工程有限公司。

1.3 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

準(zhǔn)確稱(chēng)取2 g葡萄糖(干燥至恒重)，用蒸餾水溶解后，置于1 000 mL容量瓶中定容。取6支試管分別編號(hào)，在每支試管中加入葡萄糖原液和蒸餾水，并在各試管中加入1.5 mL 3，5—二硝基水楊酸溶液搖勻，于沸水浴中加熱5 min，常溫晾置，然后加入10 mL蒸餾水，在540 nm波長(zhǎng)下依次測(cè)定吸光度。以葡萄糖的梯度溶液為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[5]。

1.4 麩皮曲的制作

按每100 kg麩皮拌入5～10 kg稻殼和30～32 kg水的比例，拌勻后放入蒸料罐，通汽加熱至罐內(nèi)壓力達(dá)0.1 MPa時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，持續(xù)30 min，停止加熱，排汽出料。

1.5 接種

將熟料出罐后攤晾至35～40 ℃，按照每50 kg麩皮拌入20 g菌種的比例進(jìn)行接種，先接入部分熟料拌勻，然后繼續(xù)撒熟料并摻拌均勻，最后打碎料塊，移入曲池。

1.6 通風(fēng)培養(yǎng)

曲料入池后，攤平，在4～5 h內(nèi)保溫保濕，不用通風(fēng)。4～5 h后，曲料溫度上升至34～35 ℃，通風(fēng)降溫，間歇開(kāi)停。10～12 h以后，曲料開(kāi)始結(jié)塊，空氣通透性差，連續(xù)通風(fēng)，或適當(dāng)打開(kāi)冷風(fēng)門(mén)，以保持曲料溫度在36～38 ℃，防止曲料失水過(guò)快。18～20 h以后，菌絲生長(zhǎng)緩慢，此時(shí)應(yīng)注意降低曲料溫度，并提高室溫，保持曲料溫度在35～38 ℃，以利于酶的形成和積累，便于成曲存放。

1.7 成熟攤晾

成熟的麩曲即可用于制醅發(fā)酵。如有剩余，可放在潔凈陰涼干燥處，攤成5 cm左右的薄層，晾干備用。

曲料入池時(shí)，要松散均勻，以利于曲霉孢子發(fā)芽和通風(fēng)。當(dāng)曲料溫度過(guò)高時(shí)，要及時(shí)采取降溫措施，防止燒曲。在前期間斷通風(fēng)階段，要做到兼顧降溫保濕；在中期連續(xù)通風(fēng)階段，要注意控制曲料溫度不高于36～38 ℃；在后期，要提高室溫排除潮氣，使成曲水分保持在30%以下。由于成曲不易儲(chǔ)存，所以最好邊生產(chǎn)邊使用。成曲含水分較多，容易升溫，導(dǎo)致酶喪失活力，所以即使是干曲也不宜久存。

1.8 糖化酶活力

糖化酶是一種外切型糖苷酶，是白酒微生物的主要代謝產(chǎn)物之一，其活力是衡量麩曲質(zhì)量的重要指標(biāo)[6]。取1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.33%的可溶性淀粉溶液，在60 ℃水浴中先預(yù)熱5 min，加入1 mL酶液(取1 g絕干曲稀釋30倍，靜置30 min)，然后在60 ℃下水浴反應(yīng)10 min，立即加入1.5 mL 3,5—二硝基水楊酸溶液，沸水水浴5 min，冷卻后加10 mL蒸餾水，搖勻后在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。干曲的糖化酶活力值的計(jì)算公式為：

(1)

式(1)中，C為由葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)查得的葡萄糖含量(mg/mL)；V為糖化原料總體積(mL)；N為酶液稀釋倍數(shù)；M為干曲質(zhì)量(g)；t為糖化時(shí)間(h)。

1.9 響應(yīng)面法優(yōu)化麩皮曲配方

1.9.1Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

種子培養(yǎng)時(shí)間、麩皮曲培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、稻殼量、接種量、加水量等都會(huì)對(duì)微生物的種群數(shù)量和酶的活性有影響。因此，本文采用以上因素2水平部分因子設(shè)計(jì)方法，即Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)(PB實(shí)驗(yàn))[7]。

1.9.2最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

響應(yīng)面擬合方程只有在考察的緊接領(lǐng)域才能充分接近真實(shí)情形，所以要想建立有效的響應(yīng)面擬合方程，就必須先接近最佳值區(qū)域，因此本實(shí)驗(yàn)采用最陡爬坡法[7]。

1.9.3響應(yīng)面分析法

為了進(jìn)一步研究相關(guān)變量之間的交互作用，并最終確定最優(yōu)點(diǎn)，采用響應(yīng)面分析法進(jìn)行直觀分析。將沒(méi)有顯著性影響的自變量設(shè)為零，觀察具有顯著性影響因素間的交互作用[8]，然后采用中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)，對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)和因素間的非線(xiàn)性關(guān)系進(jìn)行評(píng)估。

2 結(jié)果與分析

2.1 PB實(shí)驗(yàn)

研究發(fā)現(xiàn)影響麩皮曲酶活力大小的因素有6個(gè)，分別為：種子培養(yǎng)時(shí)間、麩皮曲培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、稻殼量、接種量、加水量。設(shè)計(jì)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)次數(shù)N=12，對(duì)上述6個(gè)因素進(jìn)行觀察，每個(gè)因素分2個(gè)水平，響應(yīng)值為麩皮曲的酶活力值。

Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值見(jiàn)表1。利用軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)各因素的主效應(yīng)進(jìn)行分析，Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)因素水平及其主效應(yīng)分析見(jiàn)表2。由Minitab軟件對(duì)PB實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行主效應(yīng)分析，Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)因素水平及其主效應(yīng)分析結(jié)果如圖1所示。由此可以看出，麩皮曲培養(yǎng)時(shí)間和種子培養(yǎng)時(shí)間對(duì)麩皮曲的酶活力值的影響最為明顯。因此，以這2個(gè)主要影響因素為基礎(chǔ)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值(N =12)

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)因素水平及其主效應(yīng)分析

圖1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)因素水平及其主效應(yīng)分析結(jié)果

2.2 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

以Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)進(jìn)行最陡爬坡路徑實(shí)驗(yàn)。表2中的麩皮培養(yǎng)時(shí)間具有顯著的正效應(yīng)，種子培養(yǎng)時(shí)間具有顯著的負(fù)效應(yīng)。按照這2個(gè)因素的效應(yīng)比例設(shè)定變化方向和步長(zhǎng)，其他4個(gè)因素分別取各自的低水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可以看出，最佳因素條件處于第3組和第4組之間，所以將第3組條件作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面分析。

表3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.3 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選重要因素的最優(yōu)濃度水平

通過(guò)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)確定了影響麩皮曲酶活力值的主要因素，然后利用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定接近響應(yīng)值區(qū)域的影響因素濃度，最后進(jìn)行響應(yīng)面分析。重要因素水平及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表4，其他4個(gè)因素分別取各自的低水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表4 重要因素水平及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過(guò)響應(yīng)面法繪制分析圖，考察所擬合的相應(yīng)曲面的形狀。酶活力值與麩皮曲培養(yǎng)時(shí)間、種子培養(yǎng)時(shí)間的響應(yīng)面等值線(xiàn)圖如圖2所示，相應(yīng)的響應(yīng)面立體分析圖如圖3所示。由圖2～3可以看出，響應(yīng)面存在穩(wěn)定點(diǎn)，即極大值；經(jīng)過(guò)嶺嵴分析獲得極大值，即種子培養(yǎng)時(shí)間和麩皮曲培養(yǎng)時(shí)間的最佳時(shí)間分別為33.685 7 h和30.128 6 h，此時(shí)麩皮曲的酶活力值達(dá)到最大，為127.814 2 mg/(h·g)。

圖2 響應(yīng)面等值線(xiàn)圖

圖3 響應(yīng)面立體分析圖

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

以種子培養(yǎng)時(shí)間和麩皮曲培養(yǎng)時(shí)間為主要因素，軟件分析出響應(yīng)面存在的穩(wěn)定點(diǎn)，以得出的麩皮曲的最優(yōu)配方做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，麩皮曲酶活力值分別為130.58 mg/(h·g)，133.42 mg/(h·g)，122.35 mg/(h·g)，3次結(jié)果的平均值為128.78 mg/(h·g)，與預(yù)測(cè)值127.81 mg/(h·g)非常接近，且與原始麩皮曲酶活力值99.17 mg/(h·g)相比，提高了29.9%。

3 結(jié)論

利用響應(yīng)面分析法對(duì)麩皮曲配方進(jìn)行優(yōu)化，首先用Plackett-Burman法確定出種子培養(yǎng)時(shí)間和麩皮曲培養(yǎng)時(shí)間為主要影響因素；然后通過(guò)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逐步改變二者數(shù)值，逼近最佳響應(yīng)面區(qū)域；最后用中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)及Minitab軟件分析出主要影響因素的最優(yōu)數(shù)值。麩皮曲配方的最佳培養(yǎng)條件為：種子培養(yǎng)時(shí)間為33.685 7 h，麩皮曲培養(yǎng)時(shí)間為30.128 6 h。按照此條件來(lái)培養(yǎng)麩皮曲，酶活力值達(dá)到了128.78 mg/(h·g)，與原始麩皮曲配方相比提高了29.9%。這為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)麩皮曲奠定了理論基礎(chǔ)。