李怡然，朱明慧，朱志玲，姚靜，山廣志

技術(shù)與方法

定量核磁共振波譜法測定葡萄糖酸鈣原料藥的絕對含量

李怡然，朱明慧，朱志玲，姚靜，山廣志

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所分析測試中心（李怡然、朱明慧、朱志玲、山廣志）；100050 北京，中國食品藥品檢定研究院抗腫瘤與放射藥品室（姚靜）

葡萄糖酸鈣作為臨床常用藥物，主要起降低毛細血管滲透性的作用。適用于過敏性皮膚病，如蕁麻疹、濕疹、皮膚瘙癢癥、接觸性皮炎等。作為產(chǎn)后出血的輔助用藥使用，能夠減少心血管不良反應(yīng)[1-3]，同時也是一種膳食補充劑，用于兒童、孕婦、老年人鈣的補充[4]。

葡萄糖酸鈣的制備方法有電解氧化法、溴化法、金屬催化合成法、發(fā)酵法等。發(fā)酵法因工藝穩(wěn)定，成本低廉，被多數(shù)廠家應(yīng)用。發(fā)酵法是以黑曲霉為生產(chǎn)菌種，經(jīng)菌種逐級培養(yǎng)，發(fā)酵代謝的酶將葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，再經(jīng)碳酸鈣中和精制而成[5]。

《中國藥典》2015 年版采用 EDTA 滴定法測定葡萄糖酸鈣制劑中鈣的含量[6]，對葡萄糖酸基僅采用鑒別反應(yīng)進行考察，未對其含量進行控制。有文獻采用 HPLC 法[7]或離子色譜法[8]測定葡萄糖酸鈣的含量，但由于葡萄糖酸在水溶液中存在糖酸和內(nèi)酯的轉(zhuǎn)化，容易造成測量誤差。

自 1963 年 qNMR 法[9]應(yīng)用于定量分析以來，其應(yīng)用范圍日益廣泛，各國藥典均收載了該方法。qNMR 技術(shù)的優(yōu)勢在于不需要對照品，僅以已知含量的核磁對照品作為內(nèi)標(biāo)，掃描待測物的共振峰面積直接計算 H 的個數(shù)，對化合物進行絕對含量的測定[10]，適用于無對照品原料藥的首次定量。

本文采用 qNMR 技術(shù)，利用無水氘代溶劑，排除了水分和殘留溶劑及其他無機物干擾，準(zhǔn)確測定了葡萄糖酸鈣原料的絕對含量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Bruker Avance III HD 600 MHz 核磁共振波譜儀（BBO 探頭）購自德國布魯克公司；Mettler Toledo MS105 電子分析天平購自瑞士梅特勒-托利多公司；氘代 DMSO（批號：PR-28072/07206DM1）購自美國Cambridge Isotope Laboratories 公司；葡萄糖酸鈣（批號：LC80Q34）購自北京百靈威科技有限公司；順丁烯二酸（批號：BCBM8127V，NMR對照品級，純度：99.94%）購自美國 Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取葡萄糖酸鈣和內(nèi)標(biāo)物順丁烯二酸各 10 mg，置離心管中，加入 1 ml 氘代 DMSO，超聲 5 min 使全部溶解，取 0.6 ml 置 5 mm核磁管中備用。

1.2.2 實驗方法 采用 600 MHz 核磁共振波譜儀，探頭為 BBO，軟件為 Topspin3.6.0。實驗溫度 T = 25℃；弛豫時間 D1 = 20 s；采集時間 AQ = 2 s；采集次數(shù) NS = 32 次；脈沖序列為 zg30。

1.2.3 計算方法 核磁共振波譜法采用絕對定量的方式，本試驗采用順丁烯二酸作為內(nèi)標(biāo)，直接檢測葡萄糖酸鈣的含量，計算公式[11]如下：

A1=n1m1=n1W1/M1 A2n2m2n2W2/M2

式中 m1、m2分別為化合物 1 和化合物 2 的分子個數(shù)；n1、n2分別為相應(yīng)官能團中的質(zhì)子數(shù)；W1、W2分別為其質(zhì)量；M1、M2分別為其分子量。

2 結(jié)果

2.1 方法的選擇

2.1.1 溶劑的選擇 葡萄糖酸鈣易溶于水，但實驗發(fā)現(xiàn)葡萄糖酸鈣在水中形成葡萄糖酸鈣和葡萄糖內(nèi)酯的混合物。本試驗選用氘代 DMSO 作為溶劑，使葡萄糖酸鈣保持穩(wěn)定狀態(tài)（圖 1）。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)物的選擇 內(nèi)標(biāo)應(yīng)有較高的純度，含有多個質(zhì)子。順丁烯二酸理化性質(zhì)穩(wěn)定，不與溶劑和待測物反應(yīng)，在1H-NMR 譜圖中僅存在一組共振峰，是選用較多的定量核磁內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。選取該物質(zhì) 2 個烯質(zhì)子的單峰為定量峰，該峰的化學(xué)位移（δ = 6.2），與葡萄糖酸鈣共振峰之間無干擾（圖2）。

2.1.3 定量峰的選擇 葡萄糖酸鈣化學(xué)位移歸屬見表 1，本試驗選擇葡萄糖酸鈣上 δ = 3.9 處的雙二重峰為定量峰，該峰與其他峰完全分離，不受其他峰干擾。

2.1.4 弛豫時間 通常延遲弛豫時間不小于 T1 的 5 倍。通過反轉(zhuǎn)恢復(fù)實驗對所有質(zhì)子的共振譜線的 T1 值分別進行測試，最大縱向弛豫時間為 3.95 s，因此實驗選擇 D1 為 20 s。

A B C

圖 2 供試品氫譜

表 1 化學(xué)位移歸屬

2.1.5 掃描次數(shù) 設(shè)置掃描次數(shù)分別為 8、16、32、64 次進行試驗，為了滿足信噪比的要求（S/N ≥ 250），本實驗掃描次數(shù)設(shè)置為 32 次。

2.2 方法學(xué)驗證

2.2.1 精密度試驗 取供試品溶液，連續(xù)測定 6 次，對葡萄糖酸鈣 δ = 3.9 處共振峰和順丁烯二酸 δ = 6.2 處共振峰分別進行積分，計算定量峰與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值。6 次測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.46%，方法精密度良好。

2.2.2 重復(fù)性試驗 制備葡萄糖酸鈣供試品溶液 6 份，分別測定核磁共振氫譜，計算葡萄糖酸鈣的含量。6 次測定結(jié)果的平均值為 99.47%，RSD = 0.43%，方法的重復(fù)性良好（表 2）。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 制備葡萄糖酸鈣供試品溶液，分別在室溫放置 0、2、4、8 h 后進行測定，計算樣品和內(nèi)標(biāo)定量峰面積比值。4 次測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.63%，表明該樣品在室溫條件下 8 h 內(nèi)保持穩(wěn)定。

2.2.4 線性方程 精密稱取葡萄糖酸鈣 8.20、10.07、12.64、13.75、16.23 mg，內(nèi)標(biāo)稱樣量約為 10 mg，依法測定。以葡萄糖酸鈣與內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量比（X）為橫坐標(biāo)，以葡萄糖酸鈣與內(nèi)標(biāo)定量峰面積的比值（Y）為縱坐標(biāo)，進行線性回歸，得回歸方程 Y = 0.2933X – 0.0246，相關(guān)系數(shù)= 0.9997（n = 5）。結(jié)果表明，當(dāng)內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量為 10 mg 時，葡萄糖酸鈣在 8.20 ~ 16.23 mg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表 2 含量測定

2.3 定量結(jié)果

利用質(zhì)量平衡法[12]按下式計算葡萄糖酸鈣的含量。

含量 =（100% – 干燥失重）× HPLC 純度× 100%

該樣品干燥失重結(jié)果為 0.37%，HPLC 純度為 99.96%，質(zhì)量平衡法測得含量為 99.60%，與核磁定量結(jié)果（99.47%）一致。

3 討論

本實驗優(yōu)化了1H-NMR 測定條件，選取氘代 DMSO 作為溶劑，以順丁烯二酸為內(nèi)標(biāo)，建立了葡萄糖酸鈣絕對含量測定方法。研究結(jié)果表明，葡萄糖酸鈣的 qNMR 法測定與質(zhì)量平衡法定值結(jié)果基本一致。qNMR 方法所需樣品量少，不需要特定對照品，避免原料中未知成分對測定的干擾。采用 qNMR 法對該化合物進行含量測定，操作簡便，方法專屬、快速、可靠，結(jié)果準(zhǔn)確。

隨著核磁技術(shù)發(fā)展和新式探頭的出現(xiàn)，計算機和軟件的升級換代，定量核磁共振波譜技術(shù)將在藥物質(zhì)量評價領(lǐng)域提供更廣泛的應(yīng)用。

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十三五國家科技重大專項“重大新藥創(chuàng)制”（2017ZX 09101001、2018ZX09711001）；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程系統(tǒng)創(chuàng)新團隊基金（2016-12M-3-010）

姚靜，Email：yaojh@nifdc.org.cn；山廣志，Email：shanguangzhi@imb.pumc.edu.cn

2019-09-16

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.01.014