邵洪雪，張忠玲

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，哈爾濱 150001)

富亮氨酸膠質(zhì)瘤失活1蛋白(leucine-rich glioma inactivated 1，LGI1)是一種分子量為60 000的分泌蛋白，主要表達于齒狀回。LGI1引起的癲癇發(fā)作與人類的遺傳和自身免疫病因有關(guān)。LGI1基因突變可導致常染色體顯性遺傳顳葉外側(cè)癲癇(autosomal dominant lateral temporal epilepsy，ADLTE)。ADLTE是一種罕見的以伴有聽幻覺或視幻覺的部分癲癇發(fā)作為主要表現(xiàn)的遺傳性癲癇綜合征[1]。目前，在ADLTE家族中至少發(fā)現(xiàn)了43個LGI1基因突變，其中包括28個錯義突變。大部分導致ADLTE的LGI1基因突變導致分泌缺陷。在成人中，LGI1與獲得性自身免疫性邊緣葉腦炎相關(guān)。癲癇是獲得性自身免疫性邊緣葉腦炎常見的臨床表現(xiàn)，表現(xiàn)形式主要包括部分癲癇發(fā)作、肌陣攣和全身性強直陣攣發(fā)作[2]。面-臂肌張力障礙發(fā)作具有特異性的診斷意義[3]，實驗室檢查發(fā)現(xiàn)，患者的血清及腦脊液中的LGI1抗體滴度均升高，但抗體滴度的高低只與疾病的緩解、復發(fā)相關(guān)，而與疾病的嚴重程度無關(guān)，且免疫治療效果良好[4]。目前認為LGI1抗體是具有致病性的，但其如何致病尚不清楚。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的LGI1有多種功能與癲癇相關(guān)。因此，無論是LGI1抗體與LGI1可逆性的結(jié)合，還是LGI1基因突變均可導致LGI1及其相關(guān)結(jié)構(gòu)的功能缺陷，從而導致癲癇發(fā)作?，F(xiàn)就ADLTE及LGI1抗體相關(guān)腦炎引起癲癇的致病機制予以綜述。

1 LGI1基因突變的致病性

ADLTE是一種常染色體顯性遺傳疾病，外顯率較低，只有不到50%的ADLTE患者中發(fā)現(xiàn)LGI1基因突變[5]，這表明該綜合征是遺傳異質(zhì)性的。LGI1基因突變的致病性可能涉及單倍性不足和顯性負性機制。在LGI1基因敲除小鼠模型中，純合子的基因敲除導致自發(fā)性癲癇發(fā)作和早亡，而雜合子的LGI1+/-小鼠表現(xiàn)為聽覺刺激誘發(fā)癲癇發(fā)作的閾值降低[6]。癲癇表型在純合子中較在雜合子中更為極端，這為單倍體不足的機制提供了證據(jù)。雖然在許多基因中，截斷突變導致異常信使RNA的衰變[7]，但是目前的證據(jù)表明，LGI1中的截斷突變不總是伴隨這一過程，如在攜帶LGI1基因額外拷貝的轉(zhuǎn)基因小鼠中，LGI1基因包含第6外顯子中的截斷突變，截斷了C端癲癇相關(guān)的重復域(epitempin repeat，EPTP)，只表達N端亮氨酸富集區(qū)(leucine-rich repeat，LRR)，阻止了谷氨酸能突觸的成熟，這表明突變的顯性負效應[8]。然而，由于該轉(zhuǎn)基因小鼠沒有表現(xiàn)出任何自發(fā)的癲癇表型，因此該突變小鼠是否為可靠的ADLTE模型仍不清楚。此外，LGI1在人類中的基因突變是如何通過單倍性不足或顯性負性的方式促進癲癇發(fā)生的問題仍需要解決。迄今為止，在LGI1的蛋白編碼區(qū)域已檢測到30多個ADLTE導致的突變，其中約30%的突變被預測為無義突變，約70%的突變被認為是錯義突變，會影響蛋白質(zhì)的功能[9]。研究發(fā)現(xiàn)，這些錯義突變會使蛋白質(zhì)的分泌減少或大大減少[10]。因此可以提出假想如果LGI1作用位點位于細胞膜外，那么攜帶這些特殊突變的等位基因可能是無功能的，即通過單倍體不足機制致病。如果LGI1結(jié)合蛋白在細胞膜內(nèi)，那么可能是錯義、截斷突變,可能以競爭性結(jié)合受體的顯性負性機制致病。

2 ADLTE的致病機制

2.1LGI1基因突變導致分泌蛋白缺陷 既往研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)導致ADLTE的LGI1基因突變抑制LGI1蛋白的分泌，主要通過改變LGI1的折疊和(或)翻譯后修飾引起蛋白功能喪失，從而導致癲癇表型[7]。LGI1由兩個結(jié)構(gòu)域組成，即高度保守的LRR結(jié)構(gòu)域和EPTP結(jié)構(gòu)域，其中EPTP結(jié)構(gòu)域位于C端，包含7個抗原決定基重復片段，LRR結(jié)構(gòu)域位于N端，包含3個富含亮氨酸的重復序列；LGI1的三維結(jié)構(gòu)顯示，LGI1蛋白的C端EPTP結(jié)構(gòu)域由一個包含7個葉片的β-螺旋組成，每個葉片由四條反平行的β-折疊構(gòu)成，N端與C端組裝形成一個封閉的螺旋結(jié)構(gòu)。通過二硫鍵和協(xié)調(diào)鈣離子穩(wěn)定EPTP β-螺旋結(jié)構(gòu)[11]。在已報道的LGI1基因突變中，C42R、C42G、C46R、C46F、C179R和C200R的突變翻譯到半胱氨酸殘基上導致在LRR區(qū)域的N端和C端形成二硫鍵，干擾了正常的折疊[9]。C286R突變破壞了分子內(nèi)與Cys260的二硫化，破壞了β-螺旋內(nèi)部結(jié)構(gòu)。E383A突變破壞β-螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)部的鈣離子的結(jié)構(gòu)[7]。P43R是Liu等[1]新發(fā)現(xiàn)的一個突變，位于N端帽，可以導致分泌缺陷。同時，他們還發(fā)現(xiàn)這種LGI1基因突變導致了皮質(zhì)神經(jīng)元遷移功能紊亂，這也解釋了為什么LGI1相關(guān)的癲癇主要累及顳葉。LGI1基因突變引起錯誤轉(zhuǎn)錄與折疊的缺陷蛋白的分泌引起的功能缺陷，被認為是導致單倍體功能不足的主要機制。研究發(fā)現(xiàn)，這種單倍體不足不是由于缺乏蛋白質(zhì)分泌，而是由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)質(zhì)量控制機制在細胞內(nèi)降解錯誤折疊的突變蛋白質(zhì)[12]。

2.2LGI1基因突變降低LGI1與ADAM22親和性 長期以來，抑制蛋白分泌一直是LGI1基因突變導致蛋白質(zhì)功能喪失的唯一機制。近年有文獻報道了引起ADLTE的不抑制蛋白質(zhì)分泌的LGI1基因突變機制[11，13-14]。研究發(fā)現(xiàn)，T380A、S473L、R474Q和R407C四個突變幾乎不影響蛋白質(zhì)折疊，而是選擇性地改變與ADAM相互作用的位點，干擾LGI1與ADAM22相互作用[13]。ADAM22是公認的LGI1受體，其金屬蛋白酶樣結(jié)構(gòu)域可以與LGI1的EPTP結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成LGI1-ADAM22復合物，ADAM22中的3個芳香殘基(色氨酸398、酪氨酸408、酪氨酸409)進入LGI1 EPTP螺旋邊緣的疏水囊，并以氫鍵相互連接形成LGI1-ADAM22復合物。LGI1-ADAM22復合物的晶體結(jié)構(gòu)在二聚體-二聚體組裝中顯示為2∶2 的異四聚體結(jié)構(gòu)；此外，LGI1-ADAM復合物還可以3∶3的異型六聚體結(jié)構(gòu)存在[9]。通過一個LGI1分子的LRR結(jié)構(gòu)域與另一個LGI1分子的EPTP結(jié)構(gòu)域相互作用，可以連接兩個相距遙遠的ADAM22分子。這種結(jié)構(gòu)特征支持了由ADAM22-LGI1-ADAM22的跨突觸復合物介導的跨突觸連接的觀點。在已報道的突變中，E123K和R474Q兩個人類ADLTE突變作用于LGI1-ADAM22復合物的2∶2裝配(也可能是3∶3裝配)中LGI1-LGI1相互作用的界面[15]。S473L突變減少了LGI1與ADAM22的結(jié)合[7，16]。R407C突變在三維蛋白質(zhì)模型上的定位顯示，這種突變不會引起大的結(jié)構(gòu)重排，但可能破壞LGI1與靶蛋白的相互作用[17]。Ho等[18]將22個報道的LGI1錯義突變分為分泌缺陷突變和分泌正常突變，建立并分析了兩組具有代表性的編碼突變蛋白的ADLTE小鼠模型。其中，分泌缺陷的LGI1(E383A)蛋白通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控制機制識別并被提前降解，而可分泌的LGI1(S473L)蛋白異常二聚，并選擇性地與它的一個受體ADAM22缺陷結(jié)合。這兩種突變均導致LGI1蛋白功能的喪失，使細胞內(nèi)LGI1的轉(zhuǎn)運或配體活性受到影響，并在突觸LGI1-ADAM22的相互作用減弱時匯聚[18]。該實驗表明，LGI1蛋白以及LGI1-ADAM22相互作用的破壞與癲癇密切相關(guān)。因此，無論是突變導致LGI1分泌、折疊還是與ADAM22/23連接和組裝任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)錯誤均可以引起功能障礙，從而引起癲癇表型。

2.3其他可能機制 此外，人們還研究了LGI1基因突變與神經(jīng)興奮性的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，LGI1在軸突起始段富集，并與ADAM22/23和Kv1共同定位在一個位點[14，19]。而LGI1敲除小鼠Kv1通道密度降低與海馬CA3神經(jīng)元神經(jīng)元興奮性增加有關(guān)[18]。LGI1 R474Q突變可以干擾ADAM22/23和Kv1通道的共域化[15，19]。同時，LGI1還參與了興奮性突觸的發(fā)育。LGI1的生理功能和與癲癇相關(guān)的多種LGI1基因突變的確切致病機制尚不完全清楚。此外，ADAM和Kv1也參與了癲癇的發(fā)生。因此，可以單獨評估ADAM和Kv1基因缺陷是否也可以產(chǎn)生與LGI1基因突變一樣的癲癇表型，為LGI1的致病機制提供證據(jù)支持。如果弄清楚這些問題可以更有針對性地提出LGI1癲癇的治療策略。Ho等[18]將與LGI1基因突變相關(guān)的癲癇定義為構(gòu)象性疾病，并發(fā)現(xiàn)4-苯基丁酸鹽(一種化學校正劑)可恢復LGI1 E383A與ADAM22的折疊和結(jié)合，并改善LGI1 E383A模型小鼠增加的癲癇易感性。這為LGI1基因突變相關(guān)癲癇的治療提供了新方法。

3 LGI1抗體相關(guān)腦炎的致病機制

3.1影響海馬突觸傳遞 Schulte等[20]通過蛋白質(zhì)組學分析發(fā)現(xiàn)了LGI1是突觸蛋白復合物的組成部分。既往研究表明，ADAM22作為配體與LGI1結(jié)合，突觸后致密蛋白95作為突觸后支架蛋白參與復合物的形成[21]。2010年，F(xiàn)ukata等[22]首次提出LGI1-ADAM復合物假說，他們認為細胞外分泌的LGI1在突觸間隙能連接突觸前ADAM23和突觸后ADAM22，并與突觸前鉀通道Kv1.1和由突觸后致密蛋白95介導的α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionicacid，

AMPA)受體一起組成跨突觸蛋白復合體[1]。Yamagata等[11]發(fā)現(xiàn)的LGI1-ADAM22復合物的2∶2異四聚體結(jié)構(gòu)及3∶3異六聚體結(jié)構(gòu)也支持這一假說。越來越多的證據(jù)表明，LGI1-ADAM跨膜復合物的破壞與LGI1抗體相關(guān)腦炎相關(guān)[20，23-24]。Ohkawa等[24]研究發(fā)現(xiàn)，LGI1抗體能夠靶向作用于LGI1的EPTP重復區(qū)，特異性地抑制LGI1與ADAM22/23之間的配體受體相互作用，并可逆地減少大鼠海馬神經(jīng)元的突觸AMPA受體簇，而LGI1基因敲除小鼠的海馬齒狀回AMPA受體水平顯著降低?？梢姡z傳因素或后天因素缺失引起的LGI1-ADAM22相互作用的破壞均會降低AMPA受體功能，導致癲癇表型。關(guān)于LGI1缺乏如何引起癲癇發(fā)作，F(xiàn)ukata等[25]提出了癲癇發(fā)生的解除抑制機制。他們認為海馬區(qū)的抑制性神經(jīng)元能介導強烈的反饋或前饋抑制作用，以防止網(wǎng)絡(luò)過度興奮。而LGI1-ADAM22相互作用的抑制可以可逆地減少大鼠海馬神經(jīng)元突觸AMPA受體簇的數(shù)量。如果驅(qū)動抑制性中間神經(jīng)元的AMPA受體功能降低，海馬神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的整體興奮性會因去抑制作用而增強，從而引發(fā)癲癇發(fā)作[25]。然而，Yu等[26]對LGI1缺失突變小鼠中癲癇表型的小鼠進行電生理分析發(fā)現(xiàn)，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的釋放增加，海馬中興奮性突觸傳遞增強。其可能因為LGI1和ADAM22/ADAM23在海馬的抑制性間神經(jīng)元和興奮性神經(jīng)元中均有表達，而其中某一個占主導位置，也可能是因為基因敲除的不同造成，因此有必要進行類似的重復實驗。

3.2改變神經(jīng)元興奮性 急性海馬切片的體外電生理記錄證實了邊緣腦組織-免疫球蛋白G抗體的致病性，并顯示出神經(jīng)元興奮性的增加[27]。另一份報告顯示，在LGI1-/-動物中，神經(jīng)元興奮性的增加是由于軸突和突觸前Kv1通道表達的大量減少導致[17]。這種Kv1通道表達下調(diào)可能發(fā)生在干擾AMPA受體表達之前。研究發(fā)現(xiàn)，LGI1在軸突起始段表達，并通過調(diào)節(jié)軸突Kv1.1通道的密度來調(diào)節(jié)動作電位放電，該通道是D型鉀電流的基礎(chǔ)[18]。LGI1缺失能導致Kv1.1和Kv1.2的表達下調(diào)超過50%，導致軸突D型電流限制谷氨酸釋放的能力降低，谷氨酸釋放增多，海馬網(wǎng)絡(luò)興奮性增加，從而導致癲癇發(fā)生[18]。LGI1是通過什么途徑調(diào)節(jié)胞質(zhì)鉀通道是下一個需要解決的問題。研究發(fā)現(xiàn)，LGI1的缺失減少了Kv1.2的表達，增強了內(nèi)源性興奮性，并引起癲癇，這可能是通過改變胞質(zhì)磷脂酶A2-環(huán)加氧酶2信號通路介導,塞來昔布可以修復錐體神經(jīng)元中的缺陷Kv1.2，從而降低神經(jīng)元的興奮性也驗證了這一點[28]。此外，人們還發(fā)現(xiàn)星形膠質(zhì)細胞內(nèi)向整流性鉀離子通道4.1(Kir4.1)表達的降低與LGI1相關(guān)的癲癇相關(guān)，星形膠質(zhì)細胞Kir4.1功能障礙通過抑制星形膠質(zhì)細胞特有的K+緩沖功能，使細胞外K+、谷氨酸水平升高，增加神經(jīng)元的興奮性[29]。下調(diào)Kir4.1表達可增強星形膠質(zhì)細胞中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的表達，而BDNF是癲癇形成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。BDNF基因的下調(diào)或BDNF受體TrkB的抑制已被證明可以抑制癲癇的發(fā)展[30]。因此，星形膠質(zhì)細胞Kir4.1的下調(diào)可能參與了LGI1基因突變大鼠癲癇的發(fā)生發(fā)展。雖然LGI1基因突變下調(diào)Kir4.1表達的機制尚不清楚，但有研究表明，上調(diào)谷氨酸信號轉(zhuǎn)導可下調(diào)星形膠質(zhì)細胞中Kir4.1的表達[31]，而LGI1基因突變可以增加谷氨酸的突觸釋放。可見，谷氨酸可能參與了下調(diào)LGI1基因突變大鼠星形細胞Kir4.1的表達。但Kv1.1與Kir4.1通道在LGI1相關(guān)癲癇發(fā)生中的相互作用機制有待進一步研究。

3.3影響突觸形成 Thomas等[32]發(fā)現(xiàn)，通過應用外源性LGI1可增加突觸形成，敲除LGI1可減少體內(nèi)突觸形成。這一發(fā)現(xiàn)促使人們研究LGI1在體內(nèi)和體外對突觸形成的影響及其分子機制。人們發(fā)現(xiàn)，LGI1可能通過作用于NgR1-TROY-RhoA通路影響突觸形成。在突觸形成過程中，NgR1和TROY形成受體復合體，調(diào)控RhoA信號，使RhoA活性增強，RhoA通過控制肌動蛋白細胞骨架阻斷神經(jīng)突的生長[33-34]。LGI1作為NgR1的配體，通過競爭性拮抗作用阻斷髓鞘基NgR1-配體的結(jié)合，使RhoA信號通路受阻，從而導致髓鞘誘導的生長錐塌落缺陷[35]。Thomas等[32]的研究表明，NgR1和TROY共表達能顯著增加RhoA活性，當LGI1與NgR1和TROY共同表達時，依賴RhoA的細胞收縮被完全阻斷，表明LGI1是NgR1-TROY復合物的強大拮抗劑。可見，LGI1通過競爭NgR1使依賴NgR1的RhoA活性降低促進突觸形成。而LGI1抗體能通過阻斷LGI1與NgR1的相互作用，作用于NgR1-TROY-RhoA通路，影響突觸成熟、數(shù)量和活性，抑制海馬區(qū)突觸的形成。Zhou等[36]也證實，LGI1在樹突和軸突的修剪中均起關(guān)鍵作用，當LGI1抗體存在時，軸突清除功能受損可能導致突觸連接不精確，接受區(qū)不精細，這種不精確的感官輸入可以引起傳出信號的失真，從而引起癲癇發(fā)作及記憶障礙表型。Petit-Pedrol等[37]研究了LGI1抗體相關(guān)腦炎-IgG對突觸傳遞、突觸可塑性和記憶的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未經(jīng)IgG處理的小鼠相比，IgG處理的小鼠長期突觸增強的幅度減少了一半，這驗證了LGI1抗體相關(guān)腦炎-IgG會導致記憶缺陷。可見，抑制突觸可塑性和樹突生長可能是引起認知功能障礙的重要致病機制。LGI1促進軸突修剪的具體分子機制尚不清楚，許多與LGI1相關(guān)的信號分子可能參與其中。因此，研究LGI1如何調(diào)控細胞外基質(zhì)蛋白和細胞骨架分子，促進軸突清除，將是未來研究的熱點。

4 小 結(jié)

LGI1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有多種功能，其在突觸生長、突觸間傳遞及修剪成熟、調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性中起重要作用。LGI1的致病性包括引起ADLTE的LGI1基因突變的單倍體不足機制及顯性-負性機制。LGI1基因突變引起癲癇的機制可能與LGI1蛋白錯誤折疊而被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量控制機制識別并提前降解導致分泌缺陷有關(guān)，部分分泌正常的突變引起癲癇的機制可能與LGI1與ADAM22親和力的降低有關(guān)。LGI1自身抗體通過中和特定的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，通過干擾突觸傳遞、改變神經(jīng)元興奮性、影響突觸的連接致病。研究發(fā)現(xiàn)在海馬區(qū)，補體能通過介導神經(jīng)元破壞，從而導致顳葉萎縮及持續(xù)的認知功能缺陷[38-39]。目前，LGI1抗體的致病性已得到普遍認可，但LG1抗體如何產(chǎn)生特異性尚不清楚，推測與某些病毒感染有關(guān)。病毒感染損傷的血腦屏障可能從腦組織中漏出LGI1蛋白進入外周循環(huán)，導致LGI1抗體的產(chǎn)生[40]。然而，這種情況并不能解釋LGI1自身抗體的選擇性產(chǎn)生，因為針對其他分泌蛋白的抗體尚未在患者血清中檢測到。下一步，需探明LGI1抗體相關(guān)腦炎IgG是否破壞了LGI1二聚作用、抗LRR和抗EPTP抗體是否具有致病性以及它們是否具有不同的作用。