謝中杰，袁曉晨，龔開政

(揚州大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，江蘇 揚州 225000)

血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)是構(gòu)成血管壁組織結(jié)構(gòu)和維持血管張力的主要細(xì)胞成分，其生物學(xué)行為的改變(如表型轉(zhuǎn)換、各種原因引起的增殖、凋亡)是高血壓、動脈粥樣硬化、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療術(shù)后再狹窄等血管重塑性疾病的細(xì)胞病理學(xué)基礎(chǔ)，病理性刺激可誘導(dǎo)具有收縮功能的分化型轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂性鲋澈瓦w移能力的去分化型，成人血管內(nèi)的VSMC以極低的速率增殖，且合成活性較低[1-2]。早期對VSMC的研究集中于許多蛋白質(zhì)信號通路，包括經(jīng)典的G蛋白偶聯(lián)受體和受體酪氨酸激酶參與的調(diào)節(jié)VSMC對環(huán)境刺激和生長因子的反應(yīng)。近年來，許多非蛋白質(zhì)機制和轉(zhuǎn)錄后機制[如非編碼單鏈RNA即微RNA(microRNA，miRNA)和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)介導(dǎo)的機制]在VSMC中發(fā)揮作用[3]。非編碼RNA一直處于研究的最前沿，參與正常細(xì)胞過程、疾病狀態(tài)下的功能失調(diào)。通過對lncRNA進行研究可以為VSMC的作用以及可能的相關(guān)調(diào)控機制提供新的見解?，F(xiàn)對lncRNA與VSMC研究的最新進展進行綜述。

1 lncRNA概述

1.1lncRNA的概念 lncRNA是指長度大于200個核苷酸且通常不編碼蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，根據(jù)染色體上與編碼基因的相對位置將lncRNA分為正義、反義、雙向、基因間、基因內(nèi)五種類型，lncRNA在不同組織間表達(dá)量不同，在同一組織不同生長階段也存在差異，與蛋白質(zhì)編碼基因相比，lncRNA能顯示出更多的組織特異性，在lncRNA發(fā)現(xiàn)早期，人們認(rèn)為lncRNA并不具有生物學(xué)功能，是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，后來發(fā)現(xiàn)lncRNA在基因表達(dá)調(diào)控和維持正常細(xì)胞功能方面具有重要生物學(xué)功能[4-5]。

lncRNA可以通過表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的功能機制調(diào)節(jié)基因表達(dá)，通常根據(jù)其細(xì)胞定位調(diào)節(jié)眾多細(xì)胞生長過程而發(fā)揮強大的生物學(xué)調(diào)節(jié)功能，如定位于細(xì)胞核中的lncRNA可通過引導(dǎo)或隔離轉(zhuǎn)錄因子、誘導(dǎo)組蛋白修飾、將染色質(zhì)重塑復(fù)合物引導(dǎo)至正確的染色體位置或充當(dāng)增強子RNA來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[6]。在細(xì)胞質(zhì)中，lncRNA可以作為miRNA海綿或充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)復(fù)合物的“支架”調(diào)節(jié)mRNA穩(wěn)定性并控制翻譯過程，還可參與蛋白質(zhì)磷酸化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活。此外，一些lncRNA可在外泌體或微囊泡中釋放，促進細(xì)胞間通訊。

1.2lncRNA與平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化 平滑肌細(xì)胞從收縮表型向合成表型轉(zhuǎn)化的過程稱為表型轉(zhuǎn)化，表型轉(zhuǎn)化是冠心病、冠狀動脈支架術(shù)后再狹窄、腦卒中、動脈瘤等血管疾病發(fā)生和發(fā)展的重要步驟[7]。肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1(metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)已被確立為體內(nèi)血管生成的重要調(diào)節(jié)劑，一項胸主動脈瘤相關(guān)平滑肌細(xì)胞功能的研究發(fā)現(xiàn)，MALAT1可與組蛋白去乙?；?和染色質(zhì)重塑酶Brahma相關(guān)基因1的免疫沉淀物結(jié)合，MALAT1表達(dá)的沉默可抑制該免疫沉淀物的穩(wěn)定性，從而降低基質(zhì)金屬蛋白酶-2和基質(zhì)金屬蛋白酶-9的活性，下調(diào)增殖相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)，如增殖細(xì)胞核抗原、細(xì)胞周期蛋白D1和骨橋蛋白基因，促使平滑肌細(xì)胞從合成表型轉(zhuǎn)化為收縮表型，且細(xì)胞周期停滯在G2期[8]。

心肌素蛋白是血清應(yīng)答因子的轉(zhuǎn)錄共激活因子，通過與血清應(yīng)答因子結(jié)合形成復(fù)合物，激活順式作用元件CArG盒依賴的平滑肌特異性基因(如α-平滑肌肌動蛋白的活性)，從而調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化[9]。MYOSLID(MYOcardin-induced Smooth muscle Long non-coding RNA)是一種VSMC特異性表達(dá)的lncRNA，是心肌素蛋白/血清應(yīng)答因子和轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號通路的直接轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)，可促進纖維型肌動蛋白的組裝，通過心肌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子A核轉(zhuǎn)位和下游VSMC收縮基因的轉(zhuǎn)錄激活，進而穩(wěn)定VSMC的收縮表型[10]。

lncRNA核富含豐富的轉(zhuǎn)錄本1(nuclear-enriched abundant transcript 1,NEAT1)由人第11號染色體MEN1基因位點轉(zhuǎn)錄而來，已被證實在多個腫瘤發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。Paraspeckles是一種位于哺乳動物細(xì)胞染色體間區(qū)、由NEAT1與多種RNA結(jié)合蛋白構(gòu)成的新型細(xì)胞核亞結(jié)構(gòu)小體，Wang等[11]發(fā)現(xiàn)，NEAT1在響應(yīng)來源于線粒體損傷的信號時通過增強Paraspeckles對細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄的具有調(diào)控線粒體功能的信使RNA的核滯留以反饋調(diào)節(jié)線粒體相應(yīng)的生理過程，影響線粒體形態(tài)、耗氧速率、ATP合成能力，導(dǎo)致線粒體功能紊亂，最終影響平滑肌細(xì)胞的增殖速率。Ahmed等[12]進一步研究發(fā)現(xiàn)，NEAT1可通過結(jié)合表觀遺傳活化劑WDR5(WD repeat-containing protein 5)蛋白而阻斷組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶1與WDR5相互作用，從而調(diào)控組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶1催化功能，減少血清應(yīng)答因子與平滑肌特異性基因啟動子內(nèi)的CArG盒的結(jié)合，抑制平滑肌收縮相關(guān)蛋白表達(dá)進而促進平滑肌細(xì)胞增殖和遷移。

Bell等[13]對人冠狀動脈VSMC進行RNA測序，發(fā)現(xiàn)SENCR(Smooth muscle and Endothelial cell enriched migration/differentiation-associated long Non-Coding RNA)是一種新型細(xì)胞質(zhì)定位的lncRNA，降低SENCR表達(dá)可導(dǎo)致心肌素及平滑肌收縮相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)，且許多遷移相關(guān)的基因表達(dá)升高，可穩(wěn)定平滑肌細(xì)胞收縮表型；進一步研究發(fā)現(xiàn)SENCR可響應(yīng)于層流剪切應(yīng)力變化，其通過與細(xì)胞骨架相關(guān)膜蛋白4的物理結(jié)合促進內(nèi)皮細(xì)胞黏著連接完整性，對于維持血管內(nèi)皮的完整同樣具有重要作用[14]。

1.3lncRNA作為競爭性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)調(diào)控平滑肌細(xì)胞 miRNA是20～25個核苷酸的非編碼RNA，其基于對靶基因信使RNA 3′非翻譯區(qū)的序列特異性調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性、翻譯過程，既往研究發(fā)現(xiàn)miRNA的異常水平與多種疾病相關(guān)[15]，ceRNA假說支持lncRNA可通過隔離miRNA活性，從而上調(diào)miRNA靶基因表達(dá)[16]。MALAT1作為ceRNA通過結(jié)合miR-142-3p調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬相關(guān)基因的表達(dá)，減弱人血小板衍生生長因子BB誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖和遷移[17]。Lin等[18]在研究高糖對VSMC鈣化、衰老的影響時發(fā)現(xiàn)，lncRNA-ES3與miR-34c-5p結(jié)合，作為miR-34c-5p的ceRNA，增強miR-34c-5p的靶基因BMF(Bcl-2的修飾因子)的表達(dá)調(diào)控VSMC凋亡。Wang等[19]發(fā)現(xiàn)母系表達(dá)基因3在氧化型低密度脂蛋白處理的VSMC中下調(diào)并與miR-361-5p呈負(fù)相關(guān)，可作為miR-361-5p的內(nèi)源性海綿調(diào)節(jié)高密度脂蛋白轉(zhuǎn)運相關(guān)基因ABCA1表達(dá)，進而抑制VSMC的增殖和凋亡。ceRNA假說的提出對于預(yù)測未知功能的lncRNA具有重要意義。

1.4lncRNA參與調(diào)控的信號通路 lncRNA作用機制比較復(fù)雜，能與信使RNA、DNA及蛋白質(zhì)相互作用，參與調(diào)節(jié)VSMC對環(huán)境刺激和生長因子的反應(yīng)，在多種信號通路中發(fā)揮作用。生長阻滯特異性轉(zhuǎn)錄因子5(growth arrest-special transcript 5,GAS5)是通過消減雜交篩選出的lncRNA，在某些環(huán)境因素影響下(如營養(yǎng)匱乏、低氧誘導(dǎo))，可競爭性抑制激活型糖皮質(zhì)激素受體與靶基因結(jié)合，切斷糖皮質(zhì)激素信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，進而導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞生長停滯甚至凋亡[20]。有研究表明，lncRNA-GAS5還與高血壓血管重塑有關(guān)，GAS5可通過Wnt/β聯(lián)蛋白信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)VSMC功能[21]；另外，GAS5還可通過多個Smad結(jié)合元件競爭性結(jié)合Smad3蛋白，作為分子誘餌負(fù)向調(diào)節(jié)TGF-β/Smad3信號通路，從而抑制TGF-β誘導(dǎo)的VSMC分化[22]。

1999年首次發(fā)現(xiàn)了類固醇激素受體RNA激活劑(steroid receptor RNA activator，SRA)，SRA作為RNA存在能共激活多個類固醇激素受體[23]。Zhang等[24]通過構(gòu)建股動脈損傷小鼠模型發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)lncRNA-SRA可以通過促進VSMC增殖和遷移促進損傷后新內(nèi)膜增生，生物信息學(xué)預(yù)測lncRNA-SRA與cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)相互作用。另有研究發(fā)現(xiàn)CREB可通過增強環(huán)腺苷酸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在VSMC中發(fā)揮促有絲分裂特性，且VSMC增殖與CREB激活有關(guān)，隨后實驗證實lncRNA-SRA還可通過激活分裂原活化抑制劑和胞外信號調(diào)節(jié)激酶磷酸化激活促分裂原活化的蛋白激酶信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，進而導(dǎo)致磷酸化的CREB增加[25]。

p53是參與細(xì)胞增殖和凋亡的腫瘤抑制基因，在動脈粥樣硬化進展中也起重要作用。Wu等[26]發(fā)現(xiàn)lncRNA-p21的表達(dá)在ApoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化斑塊中顯著下調(diào)，可參與p53依賴性靶基因表達(dá)的調(diào)節(jié)而不改變p53本身的表達(dá)水平，可直接與E3泛素連接酶MDM2相結(jié)合，導(dǎo)致p53從MDM2釋放并與組蛋白乙?；竝300結(jié)合，反饋增強p53的轉(zhuǎn)錄活性，促進VSMC增殖，調(diào)節(jié)損傷誘導(dǎo)的新生內(nèi)膜形成。

2 lncRNA與VSMC相關(guān)血管疾病

2.1lncRNA與動脈粥樣硬化 通常情況下，血管中膜的平滑肌細(xì)胞可以維持血管張力及結(jié)構(gòu)的完整性，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損時，平滑肌細(xì)胞會發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，遷移到損傷的血管內(nèi)膜，發(fā)生增殖異常及分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，參與動脈粥樣硬化早期纖維帽的形成；晚期VSMC遷移能力增加，是不穩(wěn)定性斑塊破裂、繼發(fā)出血和形成血栓的主要原因之一。在關(guān)于lncRNA的早期研究中，Ballantyne等[27]通過白細(xì)胞介素-1α和血小板衍生生長因子處理人大隱靜脈來源的VSMC，通過RNA測序的方法尋找差異表達(dá)的lncRNA，將lncRNA RP11-94A24.1高表達(dá)，命名為SMILR，與刺激呈時間依賴性表達(dá)增加，后聯(lián)合正電子發(fā)射計算機斷層成像在不穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊患者中得以驗證，證實了與動脈粥樣硬化之間的相關(guān)性。

心肌梗死是環(huán)境與遺傳因素共同導(dǎo)致的多基因遺傳病，全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)染色體9p21上單核苷酸多態(tài)性增加動脈粥樣硬化和心肌梗死的風(fēng)險[28]。在染色體9p21.3位點附近存在CDKN2A/B抑癌基因，編碼蛋白p16INK4a、p14ARF和p15INK4b。Motterle等[29]發(fā)現(xiàn)rs1333048、rs1333049位點促進VSMC增殖并減少p16INK4a和p15INK4b的表達(dá)，9p21區(qū)域上風(fēng)險等位基因與冠心病風(fēng)險增加之間的關(guān)聯(lián)部分歸因于VSMC的增殖。INK4基因座中反義非編碼RNA(antisense non-coding RNA in the INK4 locus,ANRIL)是CDKN2A/B基因叢轉(zhuǎn)錄的一種lncRNA，一些風(fēng)險單核苷酸的多態(tài)性會增加動脈粥樣硬化斑塊和外周血中ANRIL轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)，且與動脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[30]；多梳家族蛋白是一組參與轉(zhuǎn)錄基因抑制的蛋白，具有多梳抑制性復(fù)合物1/2兩種多蛋白復(fù)合物形式，多梳抑制性復(fù)合物1能通過單泛素化組蛋白H2A參與靶基因沉默的維持，多梳抑制性復(fù)合物2能通過催化K27H3的甲基化參與基因沉默的啟動，ANRIL能特異的結(jié)合多梳抑制性復(fù)合物2亞基和多梳抑制性復(fù)合物1亞基并調(diào)控CDKN2A/B位點的組蛋白修飾，促進異染色質(zhì)形成，用作動態(tài)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性的分子支架，啟動并維持CDKN2A/B位點的基因沉默，最終影響平滑肌細(xì)胞增殖[31]。lncRNA ANRIL已顯示出對VSMC增殖的強大調(diào)節(jié)功能，可以作為動脈粥樣硬化的潛在生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。

視網(wǎng)膜非編碼RNA3(retinal non-coding RNA3，RNCR3)最初被認(rèn)為在小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育期間表達(dá)，Shan等[32]發(fā)現(xiàn)在高脂飲食ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型中l(wèi)ncRNA-RNCR3也顯著表達(dá)，實驗證實RNCR3敲低加重了高脂血癥及炎癥因子的釋放，減少了小鼠堿燒傷誘導(dǎo)的角膜新血管生成，降低了胸主動脈的VSMC增殖、遷移能力，表明RNCR3可能在動脈粥樣硬化中發(fā)揮保護作用，進一步研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-RNCR3還可在內(nèi)皮細(xì)胞中通過競爭性結(jié)合miR-185-5p上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子Krüppel樣因子2的水平，使內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)和分泌的RNCR3可以包裝到外泌體中傳遞給平滑肌細(xì)胞從而發(fā)揮作用。

2.2lncRNA與血管緊張素Ⅱ(angiotensin，AngⅡ)及高血壓 Ang Ⅱ 是一種小多肽激素，VSMC上有血管緊張素受體，已成為原發(fā)性和繼發(fā)性高血壓分型診斷、治療、研究的重要指標(biāo)。Leung等[33]研究Ang Ⅱ 相關(guān)的lncRNA發(fā)現(xiàn)，lnc-Ang362競爭性結(jié)合miR-221和miR-222。既往研究表明miR-221和miR-222可與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子p57Kip2和p27Kip1基因結(jié)合，負(fù)責(zé)AngⅡ誘導(dǎo)的VSMC增殖，證實lnc-Ang362是AngⅡ相關(guān)心血管疾病的治療靶點[34]。

一項比較高血壓患者和健康對照人群lncRNAs差異表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，高血壓患者血漿中l(wèi)ncRNA-AK098656顯著上升，進一步研究發(fā)現(xiàn)AK098656可與肌球蛋白重鏈11、纖連蛋白FN1的必需成分結(jié)合，誘導(dǎo)VSMC合成表型，并促進兩者通過蛋白酶體介導(dǎo)降解，進而在細(xì)胞質(zhì)中充當(dāng)核酸骨架的作用，最后還通過構(gòu)建AK098656轉(zhuǎn)基因大鼠模型加以驗證[35]。

2.3lncRNA與腹主動脈瘤 VSMC表型轉(zhuǎn)變和凋亡、管壁中彈性蛋白和膠原的降解、T淋巴細(xì)胞的積累和新血管形成是動脈瘤疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵過程。Li等[36]通過Ang Ⅱ /ApoE-/-小鼠腹主動脈瘤模型發(fā)現(xiàn)lncRNA H19高表達(dá)，利用位點特異性反義寡核苷酸敲低H19可顯著限制小鼠模型中動脈瘤生長，在細(xì)胞核中，H19可與缺氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1,HIF-1)α亞基啟動子區(qū)域結(jié)合并招募轉(zhuǎn)錄因子Sp1，增強HIF-1α的表達(dá)；另外，H19的二級結(jié)構(gòu)可以結(jié)合HIF-1α蛋白將其保留在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)增加的HIF-1α直接與MDM2蛋白相互作用參與p53信號通路引發(fā)的平滑肌細(xì)胞凋亡，加速了腹主動脈瘤的發(fā)生?；蜷glncRNA-PVT1為人類漿細(xì)胞瘤多樣異位基因1(plasmacytoma variant translocation gene 1，PVT1)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，Zhang等[37]發(fā)現(xiàn)lncRNA-PVT1在腹主動脈瘤患者組織樣本中高表達(dá)，敲減PVT1治療可以通過減少VSMC凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)破壞和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，抑制AngⅡ誘導(dǎo)的腹主動脈進行性擴張。

3 小 結(jié)

非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)是生命科學(xué)的重大突破，除參與各種生物過程外，非編碼RNA在疾病診斷和治療方面的潛力得到認(rèn)可，血漿lncRNA H19已被認(rèn)為是胃癌的生物標(biāo)志物[38]。Amodio等[39]通過在體動物實驗證實GapmeR靶向MALAT1能夠降低多發(fā)性骨髓瘤活動性，突出了靶向lncRNA的治療潛力。Abudayyeh等[40]證實CRISPR/Cas13a技術(shù)能夠在哺乳動物細(xì)胞中編輯特定的RNA，達(dá)到RNA干擾相似效率，有更強特異性，且對細(xì)胞內(nèi)天然的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的影響更小。美國食品藥品管理局及歐盟委員會批準(zhǔn)ONPATTROTM(Patisiran)用于遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性成人患者[41]，治療其第一階段或第二階段多發(fā)性神經(jīng)病變，可沉默遺傳性轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白淀粉樣變性相關(guān)信使RNA的表達(dá)，減少周圍神經(jīng)中淀粉樣物質(zhì)的沉積，成功實現(xiàn)干擾小RNA分子治療疾病的臨床轉(zhuǎn)化。lncRNA能夠調(diào)節(jié)VSMC的增殖、遷移和基質(zhì)合成且均參與病變形成，盡管最近取得了一些進展，但大多數(shù)在調(diào)節(jié)VSMC表型轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要功能的lncRNA仍有待鑒定。