張 鵬 尹志良朱獻(xiàn)忠劉 康馮 剛*

（1.西南醫(yī)科大學(xué)，四川 瀘州 646000； 2.成飛醫(yī)院，四川 成都 610091； 3.南充市中心醫(yī)院·川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院，四川 南充 637000）

椎間盤病變?yōu)榕R床骨科常見疾病之一，因其病理牽延性、嚴(yán)重?fù)p傷性及其繼發(fā)炎性已逐漸被臨床所重視［1］。目前，椎間盤病變的臨床病理機(jī)制尚未完全弄明白，現(xiàn)有的相關(guān)性結(jié)論大多與患者年齡、遺傳、生物力學(xué)、生存環(huán)境等因素有關(guān)；近年來逐漸有學(xué)者提出了不同學(xué)說，從分子生物學(xué)（氧化應(yīng)激反應(yīng)、免疫炎癥）、機(jī)械力學(xué)、細(xì)胞衰老等方面闡述了其觀點(diǎn)［2］。椎間盤退行性改變的病理學(xué)基礎(chǔ)是病灶部位髓核細(xì)胞減少引起的胞外基質(zhì)合成減少和成分改變，繼發(fā)細(xì)胞快速凋亡［3］，而過度凋亡是椎間盤髓核細(xì)胞減少的直接原因［4］。研究表明，細(xì)胞凋亡與胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)有直接相關(guān)性［5］，因此，如何提高髓核細(xì)胞對氧化應(yīng)激反應(yīng)引起凋亡的防御能力，降低髓核細(xì)胞凋亡率成為了近年來治療椎間盤病變領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究熱點(diǎn)［6］。地黃Rehmannia glutinosa為玄參科地黃屬植物，其味甘、苦，性寒，塊根為常用中藥，素有清熱生津、益精填髓之功效。對于地黃藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究比較明確的為環(huán)烯醚萜類，而其中又以梓醇最為突出。研究表明，地黃梓醇等成分具有調(diào)節(jié)免疫、抗骨質(zhì)疏松、抗炎、神經(jīng)保護(hù)、抗糖尿病等多種藥效學(xué)，以及抗炎、抗氧化、抗凋亡等多種生物學(xué)效應(yīng)［7-8］，但目前對其抗椎間盤髓核細(xì)胞退變尚無系統(tǒng)全面的研究。本實(shí)驗(yàn)檢測了地黃梓醇在體外對H2O2刺激髓核細(xì)胞的影響，為加快該成分應(yīng)用于臨床相關(guān)疾病的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 雄性SD 大鼠（4～6 周齡），購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2016-0011。

1.2 試劑與藥物 地黃梓醇，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%（南京道斯夫生物科技有限公司，批號180612Z）。改良 1640 培養(yǎng)基（美國 Gibco 公司，批號1848026）；青霉素、鏈霉素混合液（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號C0222）；CCK-8 細(xì)胞活力試劑盒（日本Dojindo 公司，批號GB707）；逆轉(zhuǎn)錄及qPCR 試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號H31203）；抗TXNIP、IL-1β、NF-κB p65（英國Abcam 公司，貨號分別為ab188865、ab8320、ab7970）；抗NLRP3、caspase-1（美國STC 公司，批號分別為13158、sc-514）；TRITC 標(biāo)記的兔抗山羊二抗、FITC 標(biāo)記的羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號分別為119343、116128））；T-SOD、MDA、IL-1β（北京安迪華泰生物科技有限公司，批號分別為E-11084、E-10376、E-10083）；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒Annexin V-FITC／PI（碧云天生物技術(shù)有限公司，批號C3062M）。

1.3 儀器 多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；高速低溫離心機(jī)（美國Thermo Fisher 公司）；CO2 培養(yǎng)箱（日本Sanyo 公司）；倒置相差顯微鏡（日本Nikon 公司）；EVOS FL 無目鏡熒光倒置顯微鏡（美國AMG 公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞原代培養(yǎng) SD 大鼠用大劑量麻醉藥物處死，無菌條件下小心完整分離腰椎椎間盤，無菌PBS 沖洗干凈，小心去除非腰椎間盤組織，超凈工作臺上在解剖顯微鏡下分離椎間盤中凝膠狀髓核組織，置于無菌培養(yǎng)皿中并剪碎成1 mm3組織碎塊，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，加入2 倍量0.1% Ⅱ型膠原酶，37 ℃恒溫振蕩消化直至塊狀組織基本消失時終止消化，取上清，1 400 r／min 離心5 min，棄上清加入完全培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，倒置顯微鏡下每天觀察髓核細(xì)胞貼壁和生長情況，每3 d 更換1 次培養(yǎng)基，除去未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞。髓核細(xì)胞形成單層后，0.25%胰蛋白酶（含EDTA）進(jìn)行消化傳代，取第3 代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 CCK-8 測定梓醇安全濃度及H2O2作用最佳濃度 取對數(shù)生長期椎間盤髓核細(xì)胞，收集細(xì)胞后將細(xì)胞濃度調(diào)整為2×105／mL 并接種于96 孔板中，每孔100 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中24 h，讓其貼壁。將細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)的培養(yǎng)液吸出，設(shè)置地黃梓醇 7 個組（40、20、10、5、2.5、1.25、0 μmol／L）H2O28 個組（1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、0 μmol／L）樣品各100 μL，每組各設(shè)3 個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3 次。細(xì)胞按照上述方法處理后分別培養(yǎng)24、48 h，進(jìn)行細(xì)胞存活率測定。

2.3 分組 根據(jù)安全濃度測試結(jié)果，取對數(shù)期生長細(xì)胞隨機(jī)分為空白組、模型組（500 μmol／L H2O2）、地黃梓醇（5 μmol／L）組、地黃梓醇（10 μmol／L）組?？瞻捉M不做任何處理；模型組用500 μmol／L H2O2刺激24 h；地黃梓醇組用不同濃度成分預(yù)處理1 h 后，500 μmol／L H2O2刺激24 h。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測髓核細(xì)胞凋亡 調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105／mL 后接種于6 孔板，每孔2.5 mL，待細(xì)胞貼壁生長至70%左右時按“2.3”項(xiàng)下分組處理，24 h 后用不含EDTA 的胰酶消化髓核細(xì)胞，轉(zhuǎn)入離心管中，4 ℃、1 500 r／min 離心5 min，用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞2 次，4 ℃、1 500 r／min 離心5 min，吸棄PBS，加入100 μL 1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞，每管加入5 μL AnnexinV-FITC 和5 μL PI Stainning Solution 后輕輕混勻，在避光、室溫條件下孵育15 min，加入400 μL 1×Binding Buffer 混勻。上機(jī)檢測。

2.5 測定細(xì)胞上清液MDA、T-SOD、IL-1β 水平 調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105／mL 后接種于96 孔板中，每孔100 μL，培養(yǎng)箱培養(yǎng)中24 h 后，根據(jù)細(xì)胞分組處理細(xì)胞，收集上清液進(jìn)行T-SOD、MDA、IL-1β 水平測定，具體步驟參見試劑盒說明書。每組各設(shè)3 個復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3 次。

2.6 實(shí)時熒光定量PCR 測定TXNIP、NLRP3、casepase-1、IL-1βmRNA調(diào)整細(xì)胞濃度 為1×105／mL，接種于6 孔板，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后根據(jù)細(xì)胞分組處理，Trizol 法提取mRNA，置于PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行mRNA 擴(kuò)增，收集各組數(shù)據(jù)，并且進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，2－△△Ct法計算各基因的相對表達(dá)。引物序列見表1，PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件為預(yù)變性（95 ℃，2 min），變性（95 ℃，15 s），退火（57 ℃，15 s），延伸（72 ℃，1 min），55 個循環(huán)。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.7 Western blot 檢測蛋白表達(dá) 調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105／mL，每孔2 000 μL 接種于6 孔板，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后按“2.3”項(xiàng)下分組處理，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，BCA 試劑盒定量后100 ℃變性5 min。SDS-PAGE 凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。5% 的 BSA 室溫封閉 1 h 后一抗（1∶800）4 ℃孵育過夜。次日復(fù)溫后TBST 清洗3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，PBS 清洗。室溫下加入ECL 發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)曝光顯影，Quantity One 軟件統(tǒng)計灰度值，計算蛋白相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3 次。

2.8 免疫熒光法測定NLRP3 和TXNIP 蛋白表達(dá) 調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105／mL，每孔600 μL 接種于24 孔板，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后根據(jù)細(xì)胞分組處理，PBS 洗滌3 次后棄上清液，4%甲醛500 μL固定細(xì)胞15 min，滴加0.3% TritonX-100 打孔，5%BSA 封閉。滴加一抗，4 ℃放置過夜后復(fù)溫，滴加熒光二抗，37 ℃避光孵育，甘油封片，上機(jī)觀察并拍照。

2.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行處理，計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，假定方差齊性采用LSD 法檢驗(yàn)，未假定方差齊性采用Dunnett's T3 法檢驗(yàn)，偏態(tài)分布的計量資料組間比較采用Kruskal-wallis 秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 地黃梓醇、H2O2對大鼠髓核細(xì)胞毒性的影響 根據(jù)《美國藥典》中細(xì)胞相對增殖率與細(xì)胞毒性分級的關(guān)系，500 μmol／L H2O2作用24 h 后細(xì)胞存活率為56%左右，可用此濃度完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。地黃梓醇作用24、48 h，濃度為1.25～20 μmol／L時，細(xì)胞毒性分級≤1 級。見圖1。

圖1 地黃梓醇、H2O2對大鼠髓核細(xì)胞毒性的影響Fig.1 Effects of catalpol and H2O2on the cytotoxicity of rat nucleus pulposus cells

3.2 地黃梓醇對H2O2刺激后大鼠髓核細(xì)胞凋亡的影響 AnnexinV-FITC／PI 染色結(jié)果顯示，H2O2刺激后，細(xì)胞凋亡率上調(diào)（P＜0.01）；地黃梓醇預(yù)處理髓核細(xì)胞后，H2O2刺激所引起的細(xì)胞凋亡被抑制（P＜0.01）。見圖2。

3.3 地黃梓醇對H2O2刺激后大鼠髓核細(xì)胞上清液T-SOD、MDA、IL-1β 水平的影響 與模型組比較，地黃梓醇能上調(diào)大鼠髓核細(xì)胞上清液T-SOD水平（P＜0.05），下調(diào)MDA、IL-1β 水平（P＜0.05，P＜0.01）。見圖3。

3.4 地黃梓醇 對TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1βmRNA 表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組細(xì)胞TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1βmRNA 表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，5、10 μmol／L 地黃梓醇預(yù)處理后抑制了TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1βmRNA 表達(dá)（P＜0.05，P＜0.01），并且以10 μmol／L 作用更強(qiáng)。見圖4。

3.5 地黃梓醇 對 TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)的影響 與空白組比較，模型組TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1β 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型組比較，地黃梓醇（5、10 μmol／L）組TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖5。免疫熒光結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組NLRP3、TXNIP 表達(dá)均上調(diào)，地黃梓醇（10 μmol／L）組細(xì)胞兩者表達(dá)降低，見圖6。

3.6 地黃梓醇對NF-κB p65 蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，模型組NF-κB p65 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組比較，10 μmol／L 地黃梓醇能抑制NF-κB p65 蛋白表達(dá)（P＜0.05）。見圖7。

4 討論

圖2 地黃梓醇對H2O2刺激后大鼠髓核細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effects of catalpol on apoptosis of rat nucleus pulposus cells stimulated by H2O2

圖3 地黃梓醇對H2O2刺激后大鼠髓核細(xì)胞上清液T-SOD、MDA、IL-1β 水平影響Fig.3 Effects of catalpol on levels of T-SOD，MDA and IL-1β in supernatant of rat nucleus pulposus cells stimulated by H2O2

目前椎間盤退行性病變的治療策略主要以減輕臨床癥狀為主，包括保守治療和外科手術(shù)，如果保守治療失敗，通常會選擇通過外科手術(shù)來減輕疼痛［9］，然而，這些治療措施僅是對臨床癥狀的改善，而不是徹底解決病因。隨著臨床技術(shù)的不斷進(jìn)步，治療椎間盤退行性疾病的藥物、物理與手術(shù)療法有很大進(jìn)展，但仍然無法避免椎間盤退行性變發(fā)生，無法從根本上解決患者痛苦［10］。大量研究顯示，椎間盤退變與髓核細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，而氧化應(yīng)激環(huán)境是造成細(xì)胞凋亡的重要環(huán)節(jié)［11］。本研究采用H2O2作用于髓核細(xì)胞后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示細(xì)胞大量凋亡，而地黃梓醇能夠明顯降低其凋亡率。

SOD 被稱作機(jī)體抗氧化的第一道防線，其主要作用是清除超氧陰離子自由基（）保護(hù)細(xì)胞免受損傷［12-13］，可避免因濃度過高引起的不良反應(yīng)及損傷。MDA 是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度［14］。本實(shí)驗(yàn)中H2O2導(dǎo)致髓核細(xì)胞上清T-SOD水平降低，MDA 水平升高，加入地黃梓醇預(yù)處理后能明顯升高髓核細(xì)胞清T-SOD 水平，降低MDA水平，表明地黃梓醇能夠通過降低細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)從而實(shí)現(xiàn)抗凋亡作用。

圖4 地黃梓醇對H2O2刺激后大鼠髓核細(xì)胞TXNIP、 NLRP3、 caspase?1、 IL?1β mRNA 表達(dá)的影響Fig.4 Effects of catalpol on TXNIP，NLRP3，caspase?1 and IL?1β mRNA expression in rat nucleus pulposus cells stimulated by H2O2

圖5 地黃梓醇對H2O2刺激后大鼠髓核細(xì)胞TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1β 蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of catalpol on the expression of TXNIP，NLRP3，caspase-1 and IL-1β in rat nucleus pulposus cells stimulated by H2O2

圖6 地黃梓醇對H2O2刺激大鼠髓核細(xì)胞NLRP3 和TXNIP 的表達(dá)影響Fig.6 Effects of catalpol on the expression of TXNIP and NLRP3 in rat nucleus pulposus cells stimulated by H2O2

圖7 地黃梓醇對H2O2刺激后大鼠髓核細(xì)胞NF-κB 蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effects of catalpol on the expression of NK-κB in rat nucleus pulposus cells stimulated by H2O2

NLRP3 炎性復(fù)合體是固有免疫的重要組成部分，活化的共同上游機(jī)制包括ROS 產(chǎn)生、溶酶體破裂、細(xì)胞內(nèi)K＋外流［15-16］。MDA、T-SOD 水平反映機(jī)體脂質(zhì)損傷程度，脂質(zhì)損傷的發(fā)生常伴隨著ROS 的生成，TXNIP 作為內(nèi)源硫氧還蛋白抑制劑，能夠抑制硫氧還蛋白的活性氧清除功能，導(dǎo)致細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，而ROS 的過度產(chǎn)生可以上調(diào)TXNIP 的表達(dá)，進(jìn)而激活NLRP3 炎性小體［17-18］。本研究中，暴露于氧化應(yīng)激反應(yīng)中的髓核細(xì)胞TXNIP、NLRP3 炎性體表達(dá)增加，而地黃梓醇可明顯降低此作用。NLRP3 是一種復(fù)合體支架，在內(nèi)外源性刺激因素作用下進(jìn)行低聚化后招募procaspase-1 和ASC 形成NLRP3 炎性小體，隨后進(jìn)一步激活caspase-1，進(jìn)而促進(jìn)IL-1β 的成熟和分泌［19］。IL-1β 形成后，可以通過招募CD45＋Grhigh中性粒細(xì)胞進(jìn)一步促進(jìn)炎癥因子的釋放，以及與TNF-α 協(xié)同作用激活NF-κB 通路，引起纖維蛋白原樣2 釋放增加的雙重作用，引起細(xì)胞凋亡和纖維蛋白沉積［20］。本研究采用ELISA、Western blot、PCR 等手段檢測casepase-1、IL-1β、NF-κB 的變化情況，觀察到H2O2作用髓核細(xì)胞后出現(xiàn)髓核細(xì)胞casepase-1 表達(dá)、IL-1β 釋放、IκBα 磷酸化，導(dǎo)致NF-κB 釋放亞基p65 表達(dá)明顯增加，而地黃梓醇可明顯抑制上述作用，表明它對NLRP3 炎性體激活引起的下游產(chǎn)物增加有明顯抑制作用。

綜上所述，地黃梓醇對H2O2誘導(dǎo)的髓核細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，可能與調(diào)控ROS／NLRP3／IL-1β通路軸有關(guān)，可抑制活性氧簇激活NILRP3炎性體，引起IL-1β釋放增加，導(dǎo)致NF-κB 通路被激活，從而發(fā)揮抗凋亡作用。因此，地黃梓醇有望成為阻止髓核細(xì)胞進(jìn)一步退變的理想抗凋亡劑。