段永平 趙美榮 張春年 陳子怡

摘 要：本文基于STEM教育理念，就酶活測定實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中如何落實(shí)進(jìn)行了探討，即對(duì)酶活測定的傳統(tǒng)教學(xué)模式進(jìn)行改革，在保證落實(shí)基本教學(xué)目標(biāo)的前提下，把常用的酶促反應(yīng)條件，如反應(yīng)介質(zhì)的離子強(qiáng)度、緩沖溶液、反應(yīng)組分及其濃度為自變量條件引入課堂，指導(dǎo)學(xué)生主動(dòng)探究它們對(duì)酶促反應(yīng)的影響.通過指導(dǎo)學(xué)生查閱資料、設(shè)計(jì)初步實(shí)驗(yàn)方案、通過師生討論確定實(shí)驗(yàn)方案，最后實(shí)施實(shí)驗(yàn)方案.通過這一教學(xué)過程，加深了學(xué)生對(duì)酶及酶促反應(yīng)的深刻理解，切實(shí)培養(yǎng)、提高了學(xué)生的生物科學(xué)素養(yǎng).

關(guān)鍵詞：酶活測定;離子強(qiáng)度;緩沖溶液;輔（助）因子

中圖分類號(hào)：G642? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? 文章編號(hào)：1673-260X（2020）01-0111-02

在傳統(tǒng)的酶活測定實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，更多的是按照實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，在給定的反應(yīng)條件下測定酶促反應(yīng)的一個(gè)指標(biāo)，如某酶的米氏常數(shù)（Km）測定、某酶的活力測定等，而且在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，主要是強(qiáng)調(diào)實(shí)驗(yàn)原理、方法的掌握、操作過程規(guī)范、測定過程的先后順序、提取、反應(yīng)介質(zhì)的最適pH及控制反應(yīng)的最適溫度等驗(yàn)證性教.然而，進(jìn)行這種簡單驗(yàn)證性的實(shí)驗(yàn)教學(xué)，不能培養(yǎng)學(xué)生提出問題、分析問題、解決問題的能力，也不能激發(fā)學(xué)生主動(dòng)探究問題的積極性.

隨著教學(xué)改革的深入，STEM[科學(xué)（Science），技術(shù)（Technology），工程（Engineering），數(shù)學(xué)（Mathematics）四門學(xué)科英文首字母的縮寫]教育的理念更多的引入實(shí)驗(yàn)教學(xué)課堂，在完成一個(gè)驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)要求的基礎(chǔ)上，為了使學(xué)生能夠?qū)γ讣懊复俜磻?yīng)較深入完整的理解，還需要探討2個(gè)或2個(gè)以上因子對(duì)酶促反應(yīng)的影響，這就需要學(xué)生在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)需要跨學(xué)科考慮問題，如利用無機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)、生理學(xué)等學(xué)科的知識(shí)來解決問題.我們?cè)诰唧w的酶活力測定教學(xué)實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)常以反應(yīng)介質(zhì)的離子強(qiáng)度、緩沖溶液種類選擇、反應(yīng)組分成分及其濃度的選擇等幾個(gè)影響酶促反應(yīng)的因素作為測定酶活的自變量，以加強(qiáng)學(xué)生對(duì)酶、酶促反應(yīng)的較完整理解.現(xiàn)在使用的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)書中基本沒有有這方面的指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，因此，這就需要老師在實(shí)驗(yàn)前，指導(dǎo)學(xué)生查閱測定酶及影響酶促反應(yīng)相關(guān)因素的文獻(xiàn)等資料，初步寫出測定酶活實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)方案，然后經(jīng)過師生共同討論后，確定實(shí)驗(yàn)方案，最后實(shí)施實(shí)驗(yàn)方案.這種通過學(xué)生主動(dòng)查閱資料、自己設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)施，把學(xué)習(xí)過程由被動(dòng)變主動(dòng)，把學(xué)生的學(xué)習(xí)主體地位落到實(shí)處，促使學(xué)生對(duì)知識(shí)有較全面的理解.在選擇設(shè)計(jì)性酶活測定實(shí)驗(yàn)教學(xué)時(shí)，就需要教師需提前提示學(xué)生要注意這幾個(gè)方面的問題.

1 反應(yīng)介質(zhì)的離子強(qiáng)度和緩沖溶液的選擇

1.1 反應(yīng)介質(zhì)的離子強(qiáng)度影響酶的穩(wěn)定性

反應(yīng)介質(zhì)的離子強(qiáng)度明顯影響著酶的活性和穩(wěn)定性.在一定pH條件下，反應(yīng)介質(zhì)的離子強(qiáng)度強(qiáng)度可提高蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，即α一螺旋或β-折疊含量，以此增高酶的活性與穩(wěn)定性[1，2]，值得指出的是，這是提取或反應(yīng)介質(zhì)濃度較稀是情況下的結(jié)果，提取或反應(yīng)介質(zhì)濃度較高時(shí)會(huì)發(fā)生鹽析現(xiàn)象，影響酶的提取與反應(yīng)測定.相對(duì)于離子強(qiáng)度，離子的類型對(duì)酶穩(wěn)定性的影響較小[1];酶活測定時(shí)，加入的離子類型，在不參與反應(yīng)過程的情況下，可不做考慮.

在學(xué)生查閱、學(xué)習(xí)離子強(qiáng)度影響酶的穩(wěn)定性的相關(guān)材料過程中，會(huì)發(fā)現(xiàn)離子強(qiáng)度強(qiáng)度影響酶的活性與蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，即α一螺旋或β-折疊含量有關(guān)的問題，這一發(fā)現(xiàn)，使得學(xué)生一方面可以知道，酶的活性大小與酶蛋白分子的空間構(gòu)型有關(guān);另一方面，又提出了新的問題，即蛋白質(zhì)的二結(jié)構(gòu)的變化怎樣獲知等問題，因此，通過這樣的學(xué)習(xí)，使得學(xué)生在學(xué)習(xí)中，不斷提出問題，激發(fā)學(xué)生探究解決問題的好奇心，培養(yǎng)學(xué)生積極主動(dòng)探索生命的奧秘.

1.2 反應(yīng)介質(zhì)的離子強(qiáng)度影響酶的反應(yīng)速度

反應(yīng)介質(zhì)的離子強(qiáng)度也是影響酶反應(yīng)速度的一個(gè)重要因素之一.中間絡(luò)合物學(xué)說[3]認(rèn)為，酶的催化反應(yīng)過程是酶（E）首先將底物（S）結(jié)合在它的活性部位，生成中間復(fù)合物（SE），然后生成產(chǎn)物（P），并釋放出酶，即S+E？葑ES→P+E.

對(duì)于我們實(shí)驗(yàn)教學(xué)中常用的磷酸緩沖液來講，其含有Na+、K+離子，在含有這些離子的提取、反應(yīng)體系中，具有較高的離子強(qiáng)度，可誘使底物和酶的鄰近效應(yīng)或定向效應(yīng)，大大加快了ES復(fù)合物進(jìn)入活化狀態(tài)的機(jī)率，以此促使酶的活性得以提高[4]，對(duì)于Zn2+、Ag+等這類離子來講，既是低濃度，也會(huì)對(duì)酶的活性有抑制作用[4].

在學(xué)生獲取反應(yīng)介質(zhì)的離子強(qiáng)度影響酶的反應(yīng)速度的材料過程中，不同的離子及離子濃度使底物與酶的鄰近效應(yīng)或定向效應(yīng)是不同的，由此，使得學(xué)生對(duì)中間絡(luò)合物學(xué)說有更深層次理解.同時(shí)，還能了解離子對(duì)酶促反應(yīng)的多樣性，如有些離子會(huì)使酶活性增強(qiáng)，有些離子還會(huì)致使酶失活.

1.3 緩沖溶液的選擇

長期以來，我們?cè)诮虒W(xué)過程中，強(qiáng)調(diào)提取、測定酶活使用緩沖溶液的作用是維持酶的活性和提供反應(yīng)的最適條件，而忽視了緩沖溶液的物質(zhì)對(duì)測定酶促反應(yīng)速度的影響.在教學(xué)實(shí)踐中，我們經(jīng)常會(huì)遇到，選用不同的緩沖溶液，即使使用相同pH控制反應(yīng)介質(zhì)，我們得到的最大反應(yīng)速度也有差異.更有甚者，有些酶活測定實(shí)驗(yàn)，有的緩沖溶液還不能選用，例如，我們要測定醫(yī)學(xué)臨床上常常測定的堿性磷酸酶活性，就不應(yīng)該選擇磷酸緩沖溶液，因?yàn)?，磷酸鹽可抑制磷酸酶活性[5].

在學(xué)生學(xué)習(xí)緩沖溶液選擇相關(guān)的文獻(xiàn)過程中，使得學(xué)生更進(jìn)一步認(rèn)識(shí)到，緩沖溶液除了給酶促反應(yīng)提供反應(yīng)環(huán)境的pH穩(wěn)定的反應(yīng)環(huán)境外，其中緩沖溶液的離子還會(huì)影響酶促反應(yīng)的進(jìn)行.在酶學(xué)的研究中，盡可能給研究對(duì)象提供它在自然狀態(tài)下的介質(zhì)環(huán)境，這樣才能達(dá)到預(yù)期的結(jié)果.

2 反應(yīng)組分及其濃度的選擇

在酶活測定的反應(yīng)體系中，主要就是緩沖溶液、反應(yīng)底物和酶.緩沖溶液是反應(yīng)環(huán)境的主要提供者，反應(yīng)底物和酶是反應(yīng)的直接參與者.其中，底物濃度的大小直接影響酶促反應(yīng)的速度及最終反應(yīng)時(shí)間長短.

2.1 反應(yīng)底物濃度的確定

米氏常數(shù)（Km）數(shù)值等于酶促反應(yīng)達(dá)到其最大速度一半時(shí)的底物濃度，對(duì)于每一種酶來講，Km在一定條件下為一常數(shù)，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，基本都是以此來確定加入底物的濃度.理論上是底物濃度只有無窮大時(shí)才能實(shí)現(xiàn)，實(shí)際上，在考慮實(shí)驗(yàn)成本和環(huán)境保護(hù)因素情況下，課堂實(shí)驗(yàn)時(shí)，基本都控制在10-20倍之間的量.但是對(duì)于一些特殊的酶活測定實(shí)驗(yàn)需要特殊考慮，如乳酸脫氫酶，當(dāng)丙酮酸濃度超過一定量時(shí)，酶活性反而下降，故丙酮酸濃度不能過高[6];還有我們經(jīng)常開的實(shí)驗(yàn)——過氧化氫酶活性的測定實(shí)驗(yàn)，如果加入過氧化氫濃度過大時(shí)，也會(huì)使過氧化氫酶失活[6].

通過查閱、學(xué)習(xí)底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)的影響等知識(shí)，使得學(xué)生了解實(shí)驗(yàn)時(shí)為什么要把反應(yīng)底物加入過量及過量水平，另一方面，有些酶活測定實(shí)驗(yàn)又為什么加入不能高于一定的量，引起學(xué)生對(duì)具體酶促反應(yīng)的思考.

2.2 酶的輔（助）因子濃度確定

在測定酶活實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中，有些測定的酶屬于結(jié)合酶，即酶的蛋白部分需要非蛋白的參與才能表現(xiàn)酶的活力，我們把凡能促進(jìn)酶及反應(yīng)物進(jìn)入活化狀態(tài)，加速酶催化反應(yīng)的物質(zhì)都能稱為輔（助）因子[7].這種輔（助）因子可能是一種金屬離子激活劑或一種小分子有機(jī)物;根據(jù)小分子有機(jī)物與酶蛋白結(jié)合情況分為2種類型，結(jié)合較松散的稱為輔酶，如很多還原酶需要輔酶Ⅰ（NAD+）等參與還原;非蛋白質(zhì)部分與酶蛋白結(jié)合牢固的稱為輔基，如磷酸吡哆醛是各種轉(zhuǎn)氨酶的輔基.

2.2.1 酶的輔酶和輔基濃度的確定

作為反應(yīng)體系中的輔酶來講，它雖然不同于反應(yīng)底物，特異性不強(qiáng)，但往往參加酶促反應(yīng)的過程，即在酶反應(yīng)過程中與酶結(jié)合、分離及反復(fù)循環(huán).因此，它在作用方式上和底物類似，在酶的輔酶濃度的確定上，可將輔酶按底物處理，即可按米氏常數(shù)求出其Km，按底物規(guī)律選擇其濃度.

對(duì)于反應(yīng)體系中的輔基來講，由于它是與酶的蛋白部分結(jié)合才能使酶及反應(yīng)物進(jìn)入活化狀態(tài)，所以確定測定酶活的反應(yīng)體系輔基的加入量，與反應(yīng)體系酶的量有關(guān)，需要我們?cè)诰唧w的實(shí)驗(yàn)教學(xué)中摸索確定.值得注意的是，對(duì)于需要加入輔基的酶活測定實(shí)驗(yàn)，在酶活測定時(shí)，需要提前10-15分鐘先加入足量輔基，然后再加入底物開始酶反應(yīng).

在學(xué)生獲取輔酶和輔基濃度如何確定的材料中，使學(xué)生了解了輔酶和輔基的區(qū)別，對(duì)輔酶、輔基的加入濃度、加入時(shí)間等有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)及理解.

2.2.2 酶的金屬離子激活劑的確定

對(duì)于金屬離子激活酶活性的測定來講，需要加入特定離子才能使其反應(yīng)達(dá)到最大速度，如Na+、K+、Mg2+、Ca2+等金屬離子.由于這些離子在酶促反應(yīng)中的作用機(jī)制不同而發(fā)揮不同作用，因此，在酶活測定實(shí)驗(yàn)中，離子的種類及濃度確定需要我們具體解決.

用，因此，在酶活測定實(shí)驗(yàn)中，離子的種類及濃度確定需要我們具體解決.

在學(xué)生獲取如何確定金屬離子激活劑的相關(guān)材料中，使學(xué)生了解到，金屬離子作為酶的活化劑并不是所有酶都需要，只是部分酶的活性需要金屬離子，并且每個(gè)酶所需的離子是不同的，即使是帶相同電荷的離子，它們對(duì)酶的激活效能也是不同的.

以上是我們提示學(xué)生查找某種單因素對(duì)測定酶活的影響.但是，在具體到利用某種酶活測定實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，需要提示學(xué)生要對(duì)各個(gè)因素進(jìn)行綜合來考慮，從中選擇優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)方案，如在緩沖溶液的選擇上，除了考慮緩沖溶液的種類外，還需要考慮在提取、反應(yīng)介質(zhì)中的離子強(qiáng)度、離子類型、緩沖容量等因素.在教學(xué)過程中，需要具體問題具體分析，在要求學(xué)生全面了解具體某個(gè)酶的特性的前提下，確定實(shí)驗(yàn)方案，確保達(dá)到理想的實(shí)驗(yàn)效果.在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案的過程中，促使學(xué)生不斷地提出問題、分析問題、解決問題，從而達(dá)到以學(xué)生設(shè)計(jì)過程為主導(dǎo)，以學(xué)生的主動(dòng)實(shí)踐為中心，通過真實(shí)情景中的學(xué)習(xí)，從而落實(shí)STEM教育的理念，把培養(yǎng)學(xué)生提出問題、科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)胤治鰡栴}、解決問題等生物科學(xué)素養(yǎng)落到實(shí)處.

參考文獻(xiàn)：

〔1〕沈鴻雁，周闖，葉蘊(yùn)華，等.α-胰凝乳蛋白酶在不同介質(zhì)中穩(wěn)定性的研究[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2014，40 （4）：578-582.

〔2〕張秋會(huì)，李苗云，柳艷霞，等.離子強(qiáng)度對(duì)11S大豆球蛋白和雞肌球蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)及凝膠特性的影響[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，52（3）：424-428.

〔3〕王鏡巖，朱圣庚，徐長法，等.生物化學(xué)[M].北京：高等教育出版社，2002.355-356.

〔4〕謝喜珍，林娟，謝勇，等，海洋來源瓊膠酶的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究[J].中國生物工程雜志，2017，37（1）：47-50.

〔5〕洪燕飛，廖金花，吳國欣等.巰基化合物和磷酸鹽及其類似物對(duì)鮑魚堿性磷酸酶的抑制作用[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004，43（S1）：16-18.

〔6〕[德]H.比斯瓦根（Hans Bisswanger）[德]著.劉曉晴譯.酶學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)[M].北京，化學(xué)工業(yè)出版社，2009.21.

〔7〕袁勤生，等.現(xiàn)代酶學(xué)（第二版）[M].上海：華東理工大學(xué)出版社，2007.23-24.