昝立峰，楊香瑜，陳江魁，殷春燕

（邯鄲學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，河北省高校冀南太行山區(qū)野生資源植物應(yīng)用研發(fā)中心，河北邯鄲056005）

黑棗，學(xué)名君遷子（Diospyros lotus L.），屬于柿樹科（Ebenaceae）柿屬（Diospyros），落葉喬木[1-2]。主要分布于中國(guó)北方地區(qū)，河北的涉縣、贊皇，山西的平順、左權(quán)，山東的鄒平、淄博，湖南的洞口等地均有成片的栽培，其中河北涉縣無(wú)核黑棗種植面積達(dá)2.5 萬(wàn)余畝，每年可產(chǎn)黑棗7 000 多噸，但因缺乏相應(yīng)的深加工技術(shù)，大量果實(shí)無(wú)人采摘，造成了資源浪費(fèi)。無(wú)核黑棗果酒的研制為黑棗資源的開發(fā)利用提供了有效的途徑[3-4]。黑棗入脾胃經(jīng)，能補(bǔ)中養(yǎng)氣、養(yǎng)血、安神及明目，多用于補(bǔ)血和作為調(diào)理藥物，對(duì)貧血、血小板減少、肝炎、乏力、失眠有一定的療效[5-7]。

無(wú)核黑棗含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，尤其是還原糖、果膠、維生素、氨基酸的含量極為豐富，是研制多種食品、飲料、果酒、保健品的理想原料[8-9]。同時(shí)黑棗中含有大量的多酚類化合物，包括沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸甲酯、倍酸甲酯、鞣花酸、單寧酸、山萘酚、槲皮素、楊梅素及其衍生物等，這些多酚化合物具有良好的抗氧化、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜和抑制HIV-1 病毒作用[10-13]。本試驗(yàn)分析河北涉縣產(chǎn)無(wú)核黑棗果酒發(fā)酵過(guò)程中主要營(yíng)養(yǎng)成分的變化規(guī)律，同時(shí)對(duì)該工藝條件下黑棗果酒香氣成分進(jìn)行分析，以期為發(fā)酵型黑棗果酒的進(jìn)一步開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無(wú)核黑棗于2018 年11 月采自河北省涉縣井店鎮(zhèn)；安琪果酒酵母：安琪酵母股份有限公司；果膠酶（酶活力10×104U/g）：河南臻玉實(shí)業(yè)有限公司；檸檬酸（食品級(jí)）：濰坊英軒實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司；白砂糖：北京康普匯維科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BioFlo/CelliGen115 發(fā)酵罐：New Brunswick Scientific 公司；PHS-3E pH 酸度計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；PAL-1 數(shù)顯折射儀、PAL-33S 酒精濃度計(jì)：廈門森態(tài)儀器儀表有限公司；MKJ-J1-4 型實(shí)驗(yàn)室微波爐：青島邁威微波技術(shù)應(yīng)用有限公司；CLARUS 680氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：Perkin Elmer 公司。

1.3 方法

1.3.1 黑棗果酒發(fā)酵工藝流程

果實(shí)精選→清洗→切片→熱水浸提→果膠酶處理→調(diào)糖→調(diào)酸→高溫滅菌→接種發(fā)酵→后發(fā)酵→澄清過(guò)濾→灌裝→檢驗(yàn)→成品

1.3.2 操作要點(diǎn)

1）黑棗汁制備：將無(wú)核黑棗切成1 mm～2 mm 的薄片，稱取100 g 于燒杯中加入純水500 mL，置于微波爐中在功率為400 W 條件下微波處理5 min，然后于85 ℃下浸提得到黑棗汁，降溫至50 ℃～55 ℃，添加0.2%果膠酶保溫2 h。

2）調(diào)糖、調(diào)酸：過(guò)濾后的黑棗汁用白砂糖將可溶性固形物含量調(diào)到20%，檸檬酸調(diào)節(jié)pH 3.5。

3）主發(fā)酵：向250 mL 錐形瓶中加入100 mL 黑棗汁，在黑棗汁中加入0.2 %安琪黃酒高活性酵母，在27 ℃條件下恒溫發(fā)酵9 d。

4）后發(fā)酵：主發(fā)酵結(jié)束后，將酒腳分離，置于10 ℃后發(fā)酵30 d。

5）澄清：用0.2%的硅藻土澄清，過(guò)濾。

1.3.3 測(cè)定方法

糖度測(cè)定：數(shù)顯折射儀進(jìn)行測(cè)定；酒精度測(cè)定：酒精濃度計(jì)測(cè)定發(fā)酵液的蒸餾液中的酒精度；還原糖含量按照NY/T 1508-2017《綠色食品果酒》中的方法測(cè)定[14]。

參考GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[15]，可溶性固形物的測(cè)定采用折光儀法；總酸的測(cè)定采用酸堿滴定法；脂肪的測(cè)定采用酸水解法；蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用凱氏定氮法；還原糖的測(cè)定采用斐林試劑法；VC的測(cè)定采用2，6-二氯靛酚滴定法；多酚的測(cè)定采用福林酚法。

1.3.4 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（gas chromatographymass spectrometer，GC-MS）分析

將黑棗果酒用GC-MS 進(jìn)行成分分析。參考文獻(xiàn)[16]，色譜條件：色譜柱為HP-1（30 m× 0.25 mm ×0.25 μm），載氣為氦氣，流速 1.2 mL/min；初始柱溫為40 ℃，保持 3 min；以 20 ℃/min 的速率升溫到 240 ℃，保持 10 min；進(jìn)樣量 1 μL，分流比為 20 ∶1。質(zhì)譜條件為EI 離子源，源溫度為50 ℃，接口溫度為50 ℃，電子能量為70 eV；質(zhì)量掃描范圍為15 Da～500 Da。

1.3.5 成品質(zhì)量

在1.3.2 工藝流程下發(fā)酵無(wú)核黑棗果酒，黑棗果酒成品的質(zhì)量指標(biāo)如下：

感官指標(biāo)：顏色呈深紅色，澄清透明，無(wú)懸浮物及沉淀物；有淡淡的黑棗香氣，與酒香協(xié)調(diào)，無(wú)異味；酒體醇厚豐滿，酸甜適口。

理化指標(biāo)：酒精度：11.8%vol；可溶性固形物含量8.55%；還原糖含量1.32g/L；總酸含量3.25%。

微生物指標(biāo)：細(xì)菌總數(shù)≤50 cfu/mL；大腸菌群≤3 MPN/100 mL；致病菌未檢出。

產(chǎn)品質(zhì)量符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

黑棗果實(shí)中營(yíng)養(yǎng)成分的含量如表1 所示。

2.1 發(fā)酵過(guò)程中可溶性固形物含量的變化

黑棗果酒在發(fā)酵過(guò)程中可溶性固形物含量的變化如圖1 所示。

表1 黑棗果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)成分含量[8]Table 1 The contents of nutuitional composition from date plum fruit

圖1 黑棗果酒發(fā)酵過(guò)程中可溶性固形物含量變化Fig.1 The change of soluble solids in fermentation process of date plum fruit wine

從圖1 可以看出，在發(fā)酵過(guò)程中，可溶性固形物含量逐漸下降。在黑棗果酒發(fā)酵最初階段，酵母菌活性較好，大量消耗了試驗(yàn)中加入的蔗糖和黑棗本身所含的糖分。隨著時(shí)間的推移，酵母菌活性不斷下降，可溶性固形物含量緩慢下降，直至發(fā)酵結(jié)束。

2.2 發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量的變化

發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量的變化如圖2 所示。

圖2 黑棗果酒發(fā)酵過(guò)程中還原糖含量變化Fig.2 The change of reducing sugar in fermentation process of date plum fruit wine

從圖2 可以看出還原糖含量的變化整體呈下降趨勢(shì)，發(fā)酵1 d～3 d 下降速度較快，被消耗的還原糖主要用于酵母菌的生長(zhǎng)繁殖，而生成的酒精相對(duì)較少。但是在接下來(lái)的第3 天到第5 天，還原糖含量反而略有增加，可能因?yàn)榘l(fā)酵液中的一些蔗糖和多糖被水解成還原糖而使其含量升高。之后隨著酵母菌的利用，還原糖含量又呈急劇下降趨勢(shì)，此時(shí)還原糖被酵母轉(zhuǎn)化形成酒精，直至發(fā)酵結(jié)束，黑棗果酒中的還原糖含量降至發(fā)酵最低水平。

2.3 發(fā)酵過(guò)程中酒精度的變化

黑棗果酒在發(fā)酵過(guò)程中酒精度與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系如圖3 所示。

圖3 黑棗果酒發(fā)酵過(guò)程中酒精度變化Fig.3 The change of alcoholicity in fermentation process of date plum fruit wine

在發(fā)酵過(guò)程中，果汁中的還原糖在酵母菌的作用下轉(zhuǎn)化為酒精。由圖3 可知，在發(fā)酵的前3 天，由于酵母菌的大量繁殖，糖分主要用于菌種的生長(zhǎng)，酒精度增加相對(duì)緩慢。在發(fā)酵的第4 天到第7 天，發(fā)酵液中形成大量的乙醇，酒精度快速上升，發(fā)酵過(guò)程中表面有大量的氣泡產(chǎn)生。而第8 天以后，發(fā)酵趨于平緩，酒度緩慢上升，酒精發(fā)酵基本結(jié)束。

2.4 發(fā)酵過(guò)程中總酸含量的變化

發(fā)酵過(guò)程中總酸含量與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系如圖4所示。

圖4 黑棗果酒發(fā)酵過(guò)程中總酸含量變化Fig.4 The change of total acid in fermentation process of date plum fruit wine

從圖4 中可以看出，總酸含量在發(fā)酵的前5 天呈現(xiàn)一個(gè)上升趨勢(shì)，酵母菌利用黑棗中還原糖以及加入的蔗糖進(jìn)行發(fā)酵，糖的降解會(huì)通過(guò)戊糖磷酸途徑（hexose monophophate pathway，HMP） 等其他方式進(jìn)行，在這些途徑中會(huì)產(chǎn)生乳酸、檸檬酸等一些有機(jī)酸[17]，因此，在發(fā)酵過(guò)程中總酸含量逐漸上升，這樣有利于抑制其它雜菌的生長(zhǎng)。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，酵母菌活性逐漸下降以及糖含量逐漸下降致使有機(jī)酸的合成減少，有機(jī)酸和酒槽、單寧、色素等其它物質(zhì)的結(jié)合，維持在一個(gè)比較穩(wěn)定的水平，并略有下降，這些與其他果酒發(fā)酵過(guò)程中的規(guī)律是一致的。

2.5 發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)含量的變化

發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)含量的變化如圖5 所示。

圖5 黑棗果酒發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)含量變化Fig.5 The change of protein in fermentation process of date plum fruit wine

由圖5 可知，在發(fā)酵1 d～3 d 內(nèi)，蛋白質(zhì)含量沒(méi)有下降，3 d 后蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，7 d 后發(fā)酵趨于穩(wěn)定。蛋白質(zhì)含量的下降，一是由于發(fā)酵過(guò)程中酵母菌消耗蛋白質(zhì)作為氮源，二是由于發(fā)酵過(guò)程中大分子的蛋白與其他物質(zhì)，如單寧等結(jié)合生成沉淀。

2.6 發(fā)酵過(guò)程中脂肪含量的變化

發(fā)酵過(guò)程中脂肪含量的變化如圖6 所示。

圖6 黑棗果酒發(fā)酵過(guò)程中脂肪含量變化Fig.6 The change of fat in fermentation process of date plum fruit wine

由圖6 中可以看出，在發(fā)酵過(guò)程中脂肪含量逐漸下降。黑棗汁中的脂肪在發(fā)酵過(guò)程中，首先被酵母菌中的脂肪酶作用，分解成甘油和脂肪酸。甘油分解果酒中的單寧，提升果酒的品質(zhì)和口感，去除苦澀味。脂肪酸受到酵母菌的氧化作用而生成低級(jí)脂肪酸。脂肪酸是形成酯的前體物質(zhì)，酯與高級(jí)醇一起形成黑棗酒特有的芳香味，因此脂肪含量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。

2.7 發(fā)酵過(guò)程中VC含量的變化

黑棗果酒發(fā)酵過(guò)程中VC含量與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系如圖7 所示。

圖7 黑棗果酒發(fā)酵過(guò)程中VC 含量變化Fig.7 The change of vitamin C in brewing process of date plum fruit wine

無(wú)核黑棗中VC含量較高，VC屬己糖衍生物，存在還原型（抗壞血酸）與氧化型（脫氫抗壞血酸）兩種結(jié)構(gòu)形態(tài)，還原型VC（抗壞血酸）在有氧和無(wú)氧條件下均可分解[18]。本文采用2，6-二氯靛酚法測(cè)定還原型VC，VC含量的多少是衡量果酒營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)。從圖7 可以看出，黑棗酒發(fā)酵過(guò)程中VC含量逐漸下降，最后趨于穩(wěn)定。這是因?yàn)殡S著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液中的VC被有氧或無(wú)氧分解。

2.8 發(fā)酵過(guò)程中多酚含量的變化

發(fā)酵過(guò)程中多酚含量與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系如圖8所示。

圖8 黑棗果酒發(fā)酵過(guò)程中多酚含量變化Fig.8 The change of polyphenol in brewing process of date plum fruit wine

從圖8 可以看出，在黑棗酒發(fā)酵初期多酚的含量略有增加后有所下降，7 d 后趨于平穩(wěn)?？赡苁窃诎l(fā)酵初期，由于檸檬酸的加入，使溶液中的酸度增大，在酸性溶液中更有利于多酚從細(xì)胞中溶出。但是隨著發(fā)酵的進(jìn)行，多酚發(fā)生氧化或者與蛋白質(zhì)結(jié)合，從而使多酚的含量又逐漸降低后趨于穩(wěn)定。黑棗果酒的澀味就是由多酚引起的。多酚類物質(zhì)具有抗氧化、增強(qiáng)免疫功能、抗癌、抗衰老、調(diào)節(jié)毛細(xì)血管、抗菌、消炎、抗病毒、降血壓、降血脂、抗血栓等生物學(xué)作用[19]。果酒中的多酚類物質(zhì)賦予果酒一定的顏色，同時(shí)賦予果酒醇厚豐滿、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、后味悠長(zhǎng)的特點(diǎn)，還可以提高酒的耐貯存和抗氧化能力，因此它是構(gòu)成果酒感官品質(zhì)的重要因素之一[20]。

2.9 黑棗果酒的香氣成分分析

黑棗果酒GC-MS 所得到的總離子流圖見圖9。

圖9 黑棗果酒香氣成分GC-MS 總離子流色譜圖Fig.9 GC-MS total ion chromatogram of aroma components from date plum fruit wine

圖9 中峰形、離子豐度和分離度均較好，滿足分析的要求。將分離得到的單組份色譜峰對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖與NIST11 譜庫(kù)中質(zhì)譜圖進(jìn)行檢索匹配，分離得到的所有組分對(duì)應(yīng)質(zhì)譜檢索正負(fù)匹配較高的化合物鑒定結(jié)果列于表2 中。

從無(wú)核黑棗果酒香氣成分中共鑒定出匹配度較高的18 種成分，包括烷烴類物質(zhì)9 種、酯類物質(zhì)8 種和1 種羥胺物質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該工藝條件下果酒的主要香氣成分為烷烴類和酯類物質(zhì)，其它類物質(zhì)相對(duì)較少。酯類物質(zhì)也是酵母在發(fā)酵過(guò)程中的代謝產(chǎn)物，在無(wú)核黑棗果酒的香味方面發(fā)揮著重要的作用，如黑棗果酒中的己酸乙酯是濃香型果酒的主體香氣，乙酸乙酯是果酒的基礎(chǔ)芳香物質(zhì)，是最重要的主體酯類，其它酯類物質(zhì)也在不同程度上影響著果酒的香味。

表2 無(wú)核黑棗果酒香氣成分分析Table 2 Analysis of aroma components from date plum fruit wine

3 結(jié)論

在以河北涉縣產(chǎn)無(wú)核黑棗為原料，發(fā)酵果酒過(guò)程中可溶性固形物、還原糖、蛋白質(zhì)、脂肪、VC的含量隨著發(fā)酵時(shí)間的變化而降低，而酒精度、總酸的含量卻隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，在發(fā)酵初期多酚含量略有增加，隨后緩慢下降并保持穩(wěn)定的水平。該工藝條件下，涉縣無(wú)核黑棗果酒中酯類和烷烴類物質(zhì)構(gòu)成香氣成分的主體，其它成分含量相對(duì)較少，賦予了黑棗果酒主要香氣特征。