張峻瑋，陳玲玲，李琰，李朝輝 ，聶偉志，徐展望

(1.山東省文登整骨醫(yī)院，山東 文登 260014 ； 2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250014)

隨著經(jīng)濟(jì)社會的發(fā)展，人口老齡化趨勢嚴(yán)重，骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)的發(fā)病率也越來越高。骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減低、骨細(xì)微結(jié)構(gòu)退化、骨強(qiáng)度降低為特征的骨代謝疾病，病變廣泛，涉及全身，且常伴隨骨脆性的增加，最終導(dǎo)致骨折[1]等嚴(yán)重并發(fā)癥。中醫(yī)藥是治療骨質(zhì)疏松常用的方法之一，具有多靶點(diǎn)、多渠道、多機(jī)制的特點(diǎn)。骨碎補(bǔ)則是目前常用治療骨質(zhì)疏松癥的中藥之一，具有明顯的抗骨質(zhì)疏松的作用，但其具體作用機(jī)制尚不完全明確。

骨質(zhì)疏松癥最常用的診斷方法是雙能X射線吸收測定法(DXA)，具有操作簡單、輻射量小、花費(fèi)低等優(yōu)點(diǎn)。然而，骨骼的機(jī)械性能是由骨骼的幾何形態(tài)、微結(jié)構(gòu)特性和內(nèi)在材料特性等多因素決定的。骨質(zhì)疏松癥發(fā)生后，骨強(qiáng)度的降低，不僅僅表現(xiàn)在骨量的減少，而且與骨小梁微結(jié)構(gòu)的變化、皮質(zhì)骨形態(tài)改變、骨礦化的程度和分布，以及骨基質(zhì)和礦物質(zhì)的組成等等密切相關(guān)[2-3]。常規(guī)DXA僅僅能檢測出單位面積上的骨量即BMD(g/cm2)的變化，無法反映單位體積上骨量即BMD(g/cm3)的變化，更無法反映上述其他情況。為了更好地對骨骼微細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，以往多采用骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)分析的方法進(jìn)行研究[4]，以獲得相關(guān)指標(biāo)，如骨小梁體積百分比、骨小梁吸收面積百分比等，但過程復(fù)雜，且觀測對象為二維圖像，對骨小梁厚度、骨小梁空間結(jié)構(gòu)等眾多參數(shù)無法有效分析。高分辨率顯微CT的發(fā)展，解決了上述部分問題，具有高分辨率、低成本、使用方便、能夠在不處死動物或損傷標(biāo)本的前提下，對小動物和標(biāo)本進(jìn)行掃描的特點(diǎn)。同時利用強(qiáng)大的圖像處理軟件，可以立體三維多角度地觀察骨形態(tài)情況，克服了病理切片中因標(biāo)本形狀或結(jié)構(gòu)而限制操作或不易觀察目標(biāo)區(qū)域的困難[5]。

骨組織包括皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨。松質(zhì)骨主要負(fù)責(zé)快速骨轉(zhuǎn)換和調(diào)節(jié)全身礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)，而皮質(zhì)骨主要起支架作用[6]。發(fā)生絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松時，松質(zhì)骨的骨小梁最先發(fā)生變化，出現(xiàn)密度降低、數(shù)量減少、小梁間脂肪組織增生等變化。目前，已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)骨髓中脂肪含量與骨密度關(guān)系密切。成年后，骨髓中脂肪含量隨著年齡及絕經(jīng)時間的增加而增加，其相對量與骨組織的BMD呈負(fù)相關(guān)[6]。而在青春期前，女性骨髓中脂肪含量與BMD呈正相關(guān)，表現(xiàn)在隨著年齡增長，骨髓中脂肪含量增加，同時BMD也增加[7]。骨髓脂肪組織由脂肪細(xì)胞形成，骨髓脂肪細(xì)胞( bone marrow adiposity, BMA)呈單泡，近圓形，大小不一，平均直徑約50 μm[8]，來源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。由于BMA和成骨細(xì)胞均來源于骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞[9]，當(dāng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化增多的同時，往往伴有向成骨細(xì)胞分化的減少，因此成骨與成脂之間存在著此消彼長的關(guān)系。這個過程，受到體內(nèi)激素、骨髓微環(huán)境中細(xì)胞因子及信號通路的影響。同時，BMA還可以通過釋放相關(guān)蛋白、細(xì)胞因子反向調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及破骨細(xì)胞，進(jìn)一步影響骨代謝。以上種種研究表明，骨髓腔內(nèi)的脂肪細(xì)胞及脂肪組織不僅僅是既往認(rèn)為的起到填充骨髓腔、機(jī)械性支撐作用，還可能是一個新的內(nèi)分泌“器官”，可以通過各種機(jī)制影響骨密度及骨代謝[10]。

骨代謝指標(biāo)包括骨代謝調(diào)節(jié)激素、細(xì)胞與體液因子、骨吸收、骨形成標(biāo)志物等，雖不能作為骨質(zhì)疏松診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但通過檢測相關(guān)指標(biāo)，可以了解骨組織代謝情況，對骨質(zhì)疏松的診斷與分型、預(yù)測骨折風(fēng)險等均有較大幫助[11]。TRAP、CTX-1、MMP-9均為骨吸收標(biāo)記物。骨吸收時, 破骨細(xì)胞分泌酸和蛋白酶，在骨基質(zhì)與破骨細(xì)胞之間形成空隙,而位于破骨細(xì)胞微粒體中的TRAP ,隨即通過破骨細(xì)胞進(jìn)入此空隙, 與其他酶一起參與骨基質(zhì)的降解。因此測定血清中TRAP的濃度，有助于了解生理和病理?xiàng)l件下的骨代謝狀況，在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中，血清TRAP含量增加。CTX也是反應(yīng)骨吸收的有效標(biāo)志物，在骨質(zhì)疏松狀態(tài)下，破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，Ⅰ型膠原大量降解，形成C-末端肽，進(jìn)一步降解為CTX-1，CTX-1增多是以破骨細(xì)胞活性顯著增強(qiáng)為特點(diǎn)的[12]。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase ,MMPs)則是一族鋅離子依賴性內(nèi)肽酶, 廣泛存在于各種結(jié)締組織中,MMP-9 屬Ⅳ型膠原酶，是破骨細(xì)胞的關(guān)鍵酶, 代表破骨細(xì)胞的活性, 在破骨細(xì)胞中呈特異表達(dá), 可降解細(xì)胞外基質(zhì), 在破骨性骨吸收中發(fā)揮著重要作用[13]。

本文利用Micro-CT(micro computed tomography)及骨組織切片對實(shí)驗(yàn)大鼠骨組織形態(tài)進(jìn)行觀察，利用酶聯(lián)免疫吸附測定法 (enzyme-linked immuno sorbent assay , ELISA)對其血清骨代謝指標(biāo)進(jìn)行檢測，探討其在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中的骨保護(hù)作用及可能作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及飼養(yǎng)環(huán)境

36只健康雌性SD大鼠(SPF級)，周齡24周，體重(315.84±7.38)g，飼養(yǎng)環(huán)境清潔，通風(fēng)良好，自由飲水進(jìn)食，實(shí)驗(yàn)動物由濟(jì)南朋悅公司提供，合格證號為SCXK(魯)20140007。

1.2 主要儀器設(shè)備

骨密度儀(法國MEDILINK公司)；Micro-CT(瑞士Scanco Medical公司)；研究用萬能級顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；酶聯(lián)免疫儀(美國Biotek公司)；MMP-9、TRAP、CTX-1 ELISA試劑盒(武漢基因美公司)；低溫離心機(jī)(德國Eppendorf公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動物分組及模型建立

實(shí)驗(yàn)動物適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(OVXDF)、模型組(OVX)、假手術(shù)組(SHAM)，每組12只。OVXDF、OVX組術(shù)前禁飲食12 h，腹腔注射戊巴比妥鈉(10 g/L)麻醉，手術(shù)切除雙側(cè)卵巢[14]，假手術(shù)組(SHAM)僅摘除卵巢周圍少量脂肪組織。手術(shù)后適應(yīng)性飼養(yǎng)8周。

2.2 骨碎補(bǔ)水煎液的提取及實(shí)驗(yàn)動物灌胃

取100 g骨碎補(bǔ)(購于山東省文登整骨醫(yī)院)放入鍋中，水浸泡1 h，大火煮沸后再繼續(xù)煮30 min，濾出藥液，再次加水，二煎20 min后，再次濾出藥液，將一煎、二煎濾出藥液混合，倒入燒杯中，溫火蒸餾至100 mL，即獲得實(shí)驗(yàn)用骨碎補(bǔ)水煎液(濃度為1 g/mL)。

骨密度檢測造模成功后，實(shí)驗(yàn)組(OVXDF)參考本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究，按照4.8 g/只劑量(相當(dāng)于人體公斤體重每日用藥的10倍)給予骨碎補(bǔ)水煎液灌胃[15]，模型組(OVX)及假手術(shù)組(SHAM)給予0.9% 生理鹽水灌胃每日兩次,每次3.0 mL/只，連續(xù)12周。造模、灌胃期間無實(shí)驗(yàn)動物死亡。

2.3 大鼠骨密度測量

分別于術(shù)后及灌胃12周后將大鼠麻醉，利用雙能X光全身骨密度儀測量大鼠L4-5、雙側(cè)股骨骨密度。

2.4 脛骨干骺端骨結(jié)構(gòu)參數(shù)檢測

灌胃12周后，每組分別隨機(jī)抽取5只大鼠，放置于Micro-CT機(jī)，相同條件下(源電壓70 kV，源電流85 μA，1000投影/180度，積分時間350 ms，層厚6 μm)進(jìn)行骨掃描，掃描后相關(guān)數(shù)據(jù)上傳至Micro-CT工作站。檢測骨結(jié)構(gòu)參數(shù)，包括骨礦物質(zhì)密度BMD(g/cm3)、骨礦含量BMC(g)、反映松質(zhì)骨骨小梁骨量的BV/TV(%)、骨小梁厚度Tb.Th(μm)、骨小梁數(shù)量Tb.N(mm-1)、骨小梁分離度Tb.sp(mm)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)SMI，利用Micro-CT自帶軟件進(jìn)行分析。

2.5 大鼠外周血中TRAP、MMP-9、CTX-1含量檢測

取大鼠外周血，靜置20 min，離心后取上清液，分別按照TRAP、MMP-9、CTX-1的ELISA試劑盒說明書操作，于450 nm波長檢測各孔的光密度值并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)表達(dá)水平。

2.6 骨組織形態(tài)學(xué)觀察及分析

處死實(shí)驗(yàn)大鼠，每組取5只大鼠左側(cè)股骨，洗凈后放入10%的甲醛溶液中固定48 h，流水沖洗、蒸餾水浸泡24 h后，將標(biāo)本脫鈣，3～4 h后停止脫鈣。堿性溶液中和、流水洗滌12 h后，再分別進(jìn)行脫水、透明和浸蠟，完成后以石蠟包埋、切片，切片厚度5.0～7.0 μm，烘片時間約10～15 min。常規(guī)HE染色，光鏡下進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。

2.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，各組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 骨密度

手術(shù)后OVXDF及OVX組大鼠雙側(cè)股骨及腰椎骨密度明顯小于SHAM組，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，OVXDF及OVX組之間比較差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明骨質(zhì)疏松模型造模成功,見圖1。

圖1 術(shù)后大鼠腰椎及雙側(cè)股骨骨密度Fig.1 Postoperative density of lumbar spine and bilateral femurs

灌胃后，OVXDF組大鼠雙側(cè)股骨及腰椎骨密度較OVX組明顯升高，但仍低于SHAM組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明骨碎補(bǔ)灌胃后，可以提高去卵巢大鼠骨密度，防止骨質(zhì)疏松的進(jìn)一步發(fā)展,見圖2。

圖2 灌胃后大鼠腰椎及雙側(cè)股骨骨密度Fig.2 Density of lumbar spine and bilateral femurs after intragastric administration in rats

3.2 骨結(jié)構(gòu)參數(shù)

OVX組大鼠脛骨干骺端骨結(jié)構(gòu)參數(shù)BMD、BMC、BV/TV、Tb.Th、Tb.N較SHAM組明顯降低， Tb.sp、SMI較SHAM組明顯升高。灌胃后，即OVXDF組大鼠脛骨干骺端骨結(jié)構(gòu)參數(shù)BMD、BMC、BV/TV、Tb.Th、Tb.N 指標(biāo)明顯升高，Tb.sp、SMI明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明經(jīng)骨碎補(bǔ)灌胃后大鼠骨量、骨礦物質(zhì)含量升高，骨小梁數(shù)量及厚度增加，骨小梁之間的髓腔平均寬度減少，說明骨碎補(bǔ)可以提高骨量，減少骨吸收，如圖3、4所示。

虛線范圍內(nèi)為松質(zhì)骨骨小梁區(qū)域 圖3 灌胃后大鼠脛骨近端Micro-CT掃描Fig.3 Micro-CT scan of proximal tibia of rats after intragastric administration

圖4 灌胃后大鼠骨結(jié)構(gòu)參數(shù)Fig.4 Bone structure parameters of rats after intragastric administration

3.3 血清骨代謝指標(biāo)檢測

三組大鼠血清骨代謝指標(biāo)MMP-9、TRAP及CTX-1比較，結(jié)果為OVX大于OVXDF大于SHAM，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明去卵巢大鼠存在骨高吸收狀態(tài)，骨碎補(bǔ)灌胃后可有效抑制去卵巢大鼠的骨吸收，如圖5所示。

圖5 灌胃后三組大鼠血清骨代謝指標(biāo) Fig.5 Serum bone metabolism markers in the three groups after intragastric administration

3.4 骨組織切片觀察

灌胃后，SHAM組大鼠骨組織切片(圖6)顯示其骨皮質(zhì)較厚，髓腔較小，骨小梁粗壯、飽滿、結(jié)構(gòu)清晰，縱橫交錯呈網(wǎng)狀，排列整齊，骨組織之間存在少量脂肪顆粒且顆粒較小。OVX大鼠切片顯示其骨皮質(zhì)變薄，髓腔寬大，骨小梁稀疏、纖細(xì)、數(shù)量減少，間距變寬，結(jié)構(gòu)紊亂，骨小梁周圍可見脂肪顆粒增生，數(shù)量增多，顆粒較大。OVXDF組骨組織形態(tài)介于兩者之間。說明去卵巢大鼠骨量減少同時伴有髓腔內(nèi)脂肪組織增生，經(jīng)骨碎補(bǔ)灌胃后，骨量增加，脂肪組織形成減少。

藍(lán)色箭頭為脂肪細(xì)胞 圖6 灌胃后三組骨組織形態(tài)學(xué)觀察 Fig.6 Morphological observation of bone in the three groups after intragastric administration

4 結(jié)果與討論

(1)大鼠去卵巢后，脛骨干骺端出現(xiàn)總體骨量及骨礦物質(zhì)減少，骨小梁變薄、稀疏。而灌胃12周后，骨碎補(bǔ)升高了OVXDF組大鼠的BV/TV、Tb.Th、Tb.N、BMD、BMC，降低其Tb.sp及SMI，表明骨碎補(bǔ)可以調(diào)高去卵巢大鼠骨密度、骨礦物質(zhì)含量，增加骨小梁數(shù)量及厚度，減少骨小梁之間的髓腔平均寬度，對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠具有骨保護(hù)作用。其作用機(jī)制可能與抑制骨吸收有關(guān)。

(2)與SHAM組相比，OVX組大鼠骨組織切片中骨小梁稀疏、纖細(xì)，數(shù)量減少，間距變寬，結(jié)構(gòu)紊亂，髓腔內(nèi)骨小梁周圍可見脂肪顆粒增生，數(shù)量增多，顆粒較大。而經(jīng)骨碎補(bǔ)灌胃后，骨小梁密度增加，結(jié)構(gòu)更加清晰，形態(tài)粗壯，同時髓腔內(nèi)的脂肪顆粒組織數(shù)量減少，顆粒變小。與Micro-CT及DXA數(shù)據(jù)相比較后，也可以發(fā)現(xiàn)，OVX組大鼠在骨密度降低同時伴有脂肪組織的增生，而骨碎補(bǔ)可以有效增加骨密度，抑制因骨質(zhì)疏松引起的骨小梁變化，減少脂肪細(xì)胞及組織的增生。表明骨碎補(bǔ)對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨保護(hù)作用可能與減少其脂肪組織的形成有關(guān)。

(3)OVX組大鼠MMP-9、CTX-1及TRAP血清含量大大增加，表明絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松大鼠破骨細(xì)胞數(shù)量及活性增加，骨吸收增強(qiáng)。經(jīng)灌胃后，OVXDF組大鼠MMP-9、CTX-1及TRAP血清含量大大降低，表明骨碎補(bǔ)灌胃可以降低去卵巢大鼠破骨細(xì)胞活性及數(shù)量，減少骨吸收，從而達(dá)到防治骨質(zhì)疏松的作用。

(4)大鼠去卵巢后，不僅僅表現(xiàn)為骨量的降低，同時出現(xiàn)骨微細(xì)結(jié)構(gòu)的變化，主要表現(xiàn)在骨小梁數(shù)量減少，厚度變薄，密度降低，板狀骨小梁減少，桿狀骨小梁相對增多，同時骨小梁間脂肪細(xì)胞增生。骨碎補(bǔ)灌胃后可以有效地對抗去卵巢大鼠的骨密度降低及骨微細(xì)結(jié)構(gòu)的變化，其作用機(jī)制可能與其抑制骨髓脂肪細(xì)胞生成，抑制破骨細(xì)胞活性及數(shù)量有關(guān)聯(lián)。