代玉立，甘林，滕振勇，楊靜民，祁月月，石妞妞，陳福如，楊秀娟

玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

代玉立1，甘林1，滕振勇2，楊靜民3，祁月月4，石妞妞1，陳福如1，楊秀娟1

（1福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/福建省作物有害生物監(jiān)測(cè)與治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350013；2福建省種子管理總站，福州 350001；3建甌市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，福建建甌 353100；4浙江天豐生物科學(xué)有限公司，浙江金華 321000）

【目的】由大斑突臍蠕孢（）和玉蜀黍平臍蠕孢（）引起的玉米大斑病和小斑病是玉米生產(chǎn)上重要的葉部真菌病害，本研究旨在建立玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR檢測(cè)方法，為玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型田間分布和有性生殖研究提供技術(shù)方法?！痉椒ā扛鶕?jù)GenBank中已登錄的玉米大斑病菌（登錄號(hào)MAT1-1：GU997138和MAT1-2：GU997137）和小斑病菌（登錄號(hào)MAT1-1：X68399和MAT1-2：X68398）交配型基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)2種病原菌交配型多重PCR檢測(cè)特異性引物，采用單因素法對(duì)引物的退火溫度以及擴(kuò)增程序中延伸時(shí)間和循環(huán)數(shù)等重要參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，建立玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR檢測(cè)方法，并對(duì)2種病原菌的交配型多重PCR檢測(cè)靈敏度和特異性進(jìn)行檢驗(yàn)。同時(shí)，對(duì)田間采集的129株玉米大斑病菌和194株玉米小斑病菌單孢菌株的交配型進(jìn)行多重PCR檢測(cè)，以明確建立的交配型多重PCR檢測(cè)方法的適用性?！窘Y(jié)果】建立的多重PCR方法和設(shè)計(jì)的交配型特異引物StMAT01-2F/R、StMAT02-3F/R、ChMAT01-3F/R和ChMAT02-2F/R可分別擴(kuò)增出MAT1-1、MAT1-2型菌株大小為816、132 bp（大病斑菌）與490、136 bp（小病斑菌）的特異性目的條帶。25 μL多重PCR擴(kuò)增體系：2×Multiplex PCR Mix 12.5 μL，引物各10 pmol，DNA模板100 ng，退火溫度為57.2℃（大病斑菌）和55.0℃（小斑病菌），35個(gè)循環(huán)。該多重PCR對(duì)玉米大斑病菌MAT1-1、MAT1-2型單孢菌株的檢測(cè)靈敏度分別為0.1、0.01 ng基因組DNA，而對(duì)玉米小斑病菌MAT1-1、MAT1-2交配型的檢測(cè)靈敏度均為0.1 ng基因組DNA。該交配型多重PCR檢測(cè)方法對(duì)玉米大斑病菌和小斑病菌特異性很強(qiáng)，能夠很好地區(qū)分玉米大斑病菌和小斑病菌相應(yīng)的近緣種和14株其他真菌菌株。不同地理來源的玉米大斑病菌和小斑病菌交配型檢測(cè)結(jié)果表明，該多重PCR能夠準(zhǔn)確地檢出129株玉米大斑病菌和194株玉米小斑病菌的交配型，且檢測(cè)結(jié)果與隨機(jī)抽取的菌株雜交驗(yàn)證結(jié)果完全吻合?！窘Y(jié)論】構(gòu)建的玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR檢測(cè)方法靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)便，能夠準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)出玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型，為玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型田間分布和監(jiān)測(cè)及有性生殖研究提供了可靠的技術(shù)方法。

玉米大斑病菌；玉米小斑病菌；交配型；多重PCR；靈敏度；特異性

0 引言

【研究意義】由玉米大斑病菌（）和小斑病菌（）分別侵染玉米葉片引起的玉米大斑?。╪orthern corn leaf blight，NCLB）和小斑?。╯outhern corn leaf blight，SCLB）是世界各玉米產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生的重要葉部真菌病害[1-3]。玉米大斑病和小斑病在中國(guó)東北地區(qū)、黃淮海地區(qū)以及南方山地等玉米主產(chǎn)區(qū)發(fā)生嚴(yán)重，一般減產(chǎn)10%—30%，大暴發(fā)年份減產(chǎn)50%—100%，嚴(yán)重?fù)p害了玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)[4-5]。玉米大斑病和小斑病均為典型的流行性病害，隨氣流傳播的分生孢子可在田間循環(huán)侵染，造成病害在短時(shí)間內(nèi)流行暴發(fā)[6-8]。此外，這兩種病原菌均可在玉米生長(zhǎng)后期進(jìn)行有性生殖，造成病原菌種群內(nèi)遺傳變異頻繁、生理分化明顯以及高寄主適合度菌株不斷出現(xiàn)[9-11]，從而致使玉米新品種的抗性迅速喪失，這為我國(guó)玉米大斑病和小斑病的長(zhǎng)期可持續(xù)控制帶來了困擾。明確植物病原微生物的交配型是進(jìn)行病害有性生殖研究的基本前提，因此，建立玉米大斑病菌和小斑病菌交配型快速、準(zhǔn)確和操作簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法具有重要的實(shí)踐意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型、有性生殖及其有性后代的寄主適合度，揭示病原菌的遺傳變異機(jī)制[5,9,12]，可為制定病害的綜合防控措施提供理論參考。然而，植物病原菌不同交配型菌株間無明顯的形態(tài)學(xué)差異，研究者無法通過肉眼或顯微觀察來準(zhǔn)確判斷病原菌的交配型。傳統(tǒng)的交配型檢測(cè)方法是將待測(cè)菌株與交配型已知菌株進(jìn)行室內(nèi)雜交，通過有性子實(shí)體的形成與否，來判斷待測(cè)菌株的交配型，該方法檢測(cè)周期長(zhǎng)，易受外界因素的影響，而且往往由于菌株間交配親和能力弱而導(dǎo)致檢測(cè)失敗[13-15]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過設(shè)計(jì)特異引物用PCR方法檢測(cè)子囊菌的交配型已成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[16-17]。TAKAN等[18]根據(jù)稻瘟病菌（）MAT1-1和MAT1-2基因序列設(shè)計(jì)交配型特異引物，采用常規(guī)PCR方法檢測(cè)稻瘟病菌交配型及其在東非的地理分布；DE MICCOLIS ANGELINI等[19]設(shè)計(jì)了葡萄灰霉病菌（）交配型RT-PCR檢測(cè)特異引物，用于檢測(cè)葡萄灰霉病菌菌絲、菌核以及子囊盤時(shí)期的交配型；BREWER等[17]在研究葡萄白粉病菌（）交配型基因座結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，建立了葡萄白粉病菌交配型的多重PCR檢測(cè)方法。此外，交配型的PCR快速檢測(cè)方法還被成功應(yīng)用于蕓薹葉斑病菌（）[20]、大麥云紋病菌（）[21]、小扁豆殼二孢疫病菌（）[15]、小麥殼針孢葉枯病菌（）[22]和除蟲菊褐斑病菌（）[23]等重要植物病原菌的交配型檢測(cè)中。玉米大斑病菌和小斑病菌均屬典型的異宗配合的子囊菌[24]。目前，玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型基因序列已被克隆，兩種病原菌均具有一對(duì)在核苷酸序列上高度異源的交配型基因座，即MAT1-1和MAT1-2[25-26]。MAT1-1和MAT1-2基因在結(jié)構(gòu)上分別至少含一個(gè)-1結(jié)構(gòu)域和高泳動(dòng)蛋白家族（high mobility group，HMG）結(jié)構(gòu)域[25-26]。通過檢測(cè)-1和HMG結(jié)構(gòu)域即可準(zhǔn)確鑒定異宗配合子囊菌的交配型[16-17]。【本研究切入點(diǎn)】在前人已完成玉米大斑病菌和小斑病菌交配型基因克隆的基礎(chǔ)上，根據(jù)各自交配型基因序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)交配型檢測(cè)特異引物，構(gòu)建玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR檢測(cè)體系，提高交配型檢測(cè)的效率?！緮M解決的關(guān)鍵問題】根據(jù)玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型基因序列，設(shè)計(jì)其交配型檢測(cè)特異引物，單因素法優(yōu)化多重PCR反應(yīng)條件，建立快速、準(zhǔn)確以及可分別同時(shí)檢測(cè)玉米大斑病菌和小斑病菌交配型的多重PCR檢測(cè)方法，為玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型田間分布和監(jiān)測(cè)以及有性生殖研究提供可靠的技術(shù)手段。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018年6月至2019年7月在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所完成。

1.1 供試菌株

供試玉米大斑病菌近緣種參子凸臍蠕孢（；CGMCC編號(hào)：3.13861）、小柄凸臍蠕孢（；3.13862）和蘆葦凸臍蠕孢（；3.13863）菌株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC）；玉米圓斑病菌（）和小麥根腐病菌（）菌株分別由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院龔國(guó)淑教授和安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究所汪濤助理研究員惠贈(zèng)；供試的其他真菌菌株均由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病害研究室分離保存。玉米大斑病菌和小斑病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的編號(hào)和交配型以及其他真菌菌株見表1。

1.2 供試菌株基因組DNA的提取

將稻瘟病菌和其他供試菌株分別在淀粉瓊脂培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）平板上28℃黑暗培養(yǎng)5—7 d，用無菌手術(shù)刀輕輕刮取培養(yǎng)基表面菌絲置于2 mL無菌離心管中，供試菌株基因組DNA的提取采用改良的CTAB法[27]。DNA樣品用30 μL TE緩沖液（10 mmol·L-1Tris-HCl，1 mmol·L-1EDTA，pH 8.0）溶解，核酸定量?jī)x測(cè)定各菌株DNA的濃度并用TE緩沖液調(diào)節(jié)至100 ng·μL-1，DNA樣品于-80℃冰箱中保存。

1.3 多重PCR特異性引物的設(shè)計(jì)

從GenBank網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載玉米大斑病菌交配型MAT1-1和MAT1-2（登錄號(hào)：GU997138和GU997137）以及玉米小斑病菌交配型MAT1-1和MAT1-2（登錄號(hào)X68399和X68398）的基因序列[25-26]。利用DNAMAN 5.0軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)，尋找各交配型基因的保守序列。通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)交配型多重PCR檢測(cè)的特異引物，利用Primer-BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ tools/primer-blast/）在線工具對(duì)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行特異性檢驗(yàn)[28]。引物委托上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 多重PCR反應(yīng)體系的建立

由于多重PCR使用的是大連寶生物工程有限公司生產(chǎn)的2×Multiplex PCR試劑盒（V2.0），因此，重點(diǎn)對(duì)影響多重PCR反應(yīng)體系的引物退火溫度以及擴(kuò)增程序中延伸時(shí)間和循環(huán)數(shù)等重要參數(shù)分別進(jìn)行單因素優(yōu)化，其余試劑用量和擴(kuò)增條件嚴(yán)格按照試劑盒推薦劑量和擴(kuò)增條件。玉米大斑病菌和小斑病菌交配型的多重PCR檢測(cè)特異引物的退火溫度分別設(shè)置為62.0、61.6、60.7、59.1、57.2、55.6、54.5、54.0℃和56.0、55.6、54.7、53.1、51.2、49.6、48.5、48.0℃；多重PCR反應(yīng)體系的延伸時(shí)間分別設(shè)置為30、45和60 s；循環(huán)數(shù)分別設(shè)為30、35和40次。擴(kuò)增反應(yīng)在Bio-Rad C1000TM型梯度PCR儀中進(jìn)行。擴(kuò)增結(jié)束后取7 μL擴(kuò)增產(chǎn)物于120 v恒定電壓下用含EB的1.5%瓊脂糖電泳20 min，UVP BioDoc-ItTM凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)并拍照。

表1 供試菌株信息

CGMCC：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心China General Microbiological Culture Collection Center；ND：不確定not determined

1.5 交配型多重PCR檢測(cè)的驗(yàn)證

分別以12株玉米大斑病菌和小斑病菌交配型已知菌株的基因組DNA為模板（表1），利用優(yōu)化的多重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，以不加模板DNA為空白對(duì)照。每菌株5個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。檢驗(yàn)設(shè)計(jì)的玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

1.6 多重PCR靈敏度檢測(cè)

取交配型為MAT1-1和MAT1-2型玉米大斑病菌菌株的基因組DNA各1份，將DNA模板按10倍梯度稀釋，獲得濃度梯度為100、10、1、10-1、10-2、10-3和10-4ng·μL-1；玉米小斑病菌MAT1-1和MAT1-2型菌株的DNA濃度梯度設(shè)置為10、1、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5ng·μL-1，利用優(yōu)化的多重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，每25 μL PCR體系取上述各濃度DNA模板1 μL，以不加模板DNA為空白對(duì)照。每濃度梯度5個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。檢驗(yàn)玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR檢測(cè)的靈敏度。

1.7 多重PCR特異性檢測(cè)

選取玉米大斑病菌和小斑病菌MAT1-1和MAT1-2型菌株的基因組DNA各3份，分別以和近緣種以及其他14個(gè)屬（種）真菌基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照（表1），以不加模板DNA為空白對(duì)照。每菌株設(shè)置5個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。檢驗(yàn)玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR檢測(cè)的特異性。

1.8 多重PCR檢測(cè)體系的應(yīng)用

從福建、安徽、海南、浙江和廣東省采集田間感染玉米大斑病和小斑病的病葉標(biāo)本，采用單孢分離純化法獲得田間玉米大斑病菌和小斑病菌菌株分別為129和194株[29-30]，按上述方法提取各菌株的基因組DNA，利用本研究設(shè)計(jì)的交配型特異性引物和優(yōu)化的多重PCR反應(yīng)體系進(jìn)行玉米大斑病菌和小斑病菌交配型檢測(cè)。分別從福建省不同地區(qū)以及安徽、海南、浙江和廣東省隨機(jī)選取玉米大斑病菌或小斑病菌菌株5—10株。分別參考郭麗媛等[9]和OIDE等[31]方法與交配型已知的標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行室內(nèi)雜交，以驗(yàn)證該多重PCR檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 多重PCR特異性引物的設(shè)計(jì)

通過DNAMAN 5.0軟件的多重序列比對(duì)，利用Primer Premier 5.0軟件篩選出4對(duì)較為理想的多重PCR引物用于玉米大斑病菌和小斑病菌交配型的檢測(cè)。引物StMAT01-2F/R和StMAT02-3F/R分別用于檢測(cè)玉米大斑病菌MAT1-1和MAT1-2交配型，預(yù)期PCR產(chǎn)物大小分別為816和132 bp；引物ChMAT01- 3F/R和ChMAT02-2F/R分別用于檢測(cè)玉米小斑病菌MAT1-1和MAT1-2交配型，預(yù)期產(chǎn)物大小分別為490和136 bp（圖1、表2）。Primer-BLAST檢驗(yàn)結(jié)果表明，這4對(duì)引物的特異性較好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 多重PCR反應(yīng)體系的建立

通過對(duì)引物的退火溫度以及擴(kuò)增程序中延伸時(shí)間和循環(huán)數(shù)的單因素優(yōu)化，最終明確玉米大斑病菌交配型多重PCR檢測(cè)體系（25 μL）為2×Multiplex PCR Mix 12.5 μL，引物各10 pmol，DNA模板100 ng，補(bǔ)充ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94℃ 45 s，57.2℃ 45 s，72℃ 60 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min（表2）。

玉米小斑病菌交配型多重PCR檢測(cè)體系（25 μL）為2×Multiplex PCR Mix 12.5 μL，引物各10 pmol，DNA模板100 ng，補(bǔ)充ddH2O至25 μL。反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min（表2）。

2.3 交配型多重PCR檢測(cè)的驗(yàn)證

利用本研究設(shè)計(jì)的交配型特異引物和優(yōu)化的反應(yīng)體系分別對(duì)12株已知交配型的玉米大斑病菌和小斑病菌進(jìn)行多重PCR檢測(cè)，結(jié)果表明引物StMAT01- 2F/R對(duì)所有MAT1-1型的玉米大斑病菌菌株可擴(kuò)增出一條816 bp的特異性條帶，對(duì)交配型為MAT1-2型的菌株則未擴(kuò)增出條帶；相反，引物StMAT02-3F/R對(duì)所有MAT1-2型的玉米大斑病菌菌株可擴(kuò)增出一條132 bp的特異性條帶，而對(duì)MAT1-1型的菌株則未擴(kuò)增出任何條帶（圖2-A）。引物ChMAT01-3F/R和ChMAT02-2F/R分別僅對(duì)交配型為MAT1-1和MAT1-2的玉米小斑病菌菌株擴(kuò)增出一條490和136 bp的特異性條帶（圖2-B）。玉米大斑病菌和小斑病菌交配型的多重PCR檢測(cè)結(jié)果與菌株的交配型完全一致，表明設(shè)計(jì)的交配型特異引物和建立的多重PCR反應(yīng)體系準(zhǔn)確性高，可用于玉米大斑病菌和小斑病菌交配型的快速檢測(cè)。

紅色和藍(lán)色的方框及箭頭分別表示玉米大斑病菌（A）和小斑病菌（B）交配型MAT1-1和MAT1-2型特異引物結(jié)合位點(diǎn)

表2 玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR檢測(cè)的特異引物

2.4 多重PCR靈敏度檢測(cè)

優(yōu)化的多重PCR檢測(cè)體系對(duì)玉米大斑病菌MAT1-1交配型的檢測(cè)靈敏度為0.1 ng基因組DNA，而對(duì)MAT1-2交配型的檢測(cè)靈敏度達(dá)0.01 ng基因組DNA（圖3-A）。對(duì)玉米小斑病菌MAT1-1和MAT1-2交配型的檢測(cè)靈敏度均為0.1 ng基因組DNA（圖3-B）。

M：2 kb DNA ladder；1—12：表1中列舉的12株交配型已知的玉米大斑病菌（A）和小斑病菌（B）菌株

M：2 kb DNA ladder；1—7：（A）玉米大斑病菌MAT1-1和MAT1-2交配型菌株的基因組DNA的量為100、10、1、0.1、0.01、0.001和0.0001 ng Genomic DNA from MAT1-1 and MAT1-2 strains of E. turcicum at amounts of 100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 and 0.0001 ng, respectively；（B）玉米小斑病菌MAT1-1和MAT1-2交配型菌株的基因組DNA的量為10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001和0.00001 ng Genomic DNA from MAT1-1 and MAT1-2 strains of B. maydis at amounts of 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001 and 0.00001 ng, respectively；8：空白對(duì)照reagent only without DNA template

2.5 多重PCR特異性檢測(cè)

建立的多重PCR檢測(cè)體系中，引物StMAT01- 2F/R和StMAT02-3F/R分別僅對(duì)玉米大斑病菌MAT1-1和MAT1-2型菌株擴(kuò)增出一條特異性條帶，而對(duì)4株近緣種和14株其他真菌菌株未擴(kuò)增出任何條帶（圖4-A）。引物ChMAT01-3F/R和ChMAT02- 2F/R分別僅對(duì)交配型為MAT1-1和MAT1-2的玉米小斑病菌擴(kuò)增出一條490和136 bp的特異性條帶，而對(duì)4株近緣種和14株其他真菌菌株未檢測(cè)出特異性條帶（圖4-B）。

M：2 kb DNA ladder；1—6：分別為3株MAT1-1和MAT1-2的玉米大斑病菌（A）和小斑病菌（B）菌株Three MAT1-1 and MAT1-2 strains of E. turcicum (A) and B. maydis (B), respectively；7—10：表1所示的4株玉米大斑病菌（A）和小斑病菌（B）近緣種菌株Four strains of closely related species of Exserohilum (A) and Bipolaris (B), respectively, listed in Table 1；11—24：表1所示的14株其他真菌菌株Fourteen strains of other fungal species listed in Table 1

2.6 多重PCR檢測(cè)體系的應(yīng)用

分別從福建、安徽、浙江、廣東和海南省分離的129和194株玉米大斑病菌和小斑病菌單孢菌株中提取基因組DNA，進(jìn)行玉米大斑病菌和小斑病菌交配型的多重PCR檢測(cè)。結(jié)果表明129和194株不同省份的玉米大斑病菌和小斑病菌均檢測(cè)到MAT1-1和MAT1-2兩種交配型，玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型檢測(cè)成功率均為100%（表3）。所有菌株均為無性態(tài)菌株，未檢測(cè)到有性態(tài)菌株。室內(nèi)雜交驗(yàn)證結(jié)果表明，與標(biāo)準(zhǔn)菌株雜交也能夠成功檢測(cè)出隨機(jī)抽取菌株的交配型，且檢測(cè)結(jié)果與多重PCR檢測(cè)結(jié)果完全一致（表3）。上述結(jié)果表明，通過本研究設(shè)計(jì)的交配型特異引物和建立的多重PCR檢測(cè)體系可對(duì)玉米大斑病菌和小斑病菌MAT1-1和MAT1-2兩種交配型的菌株進(jìn)行快速檢測(cè)。

3 討論

有性重組是植物病原菌遺傳變異的重要來源，是病原菌強(qiáng)致病力新小種的出現(xiàn)、抗藥性的產(chǎn)生以及高寄主適合度菌株形成的主要途徑[32-33]。玉米大斑病和小斑病均為典型的氣流傳播性病害，可在田間短期內(nèi)流行暴發(fā)，且該病原菌具有寄主適應(yīng)性強(qiáng)、生理分化明顯以及遺傳變異性等特點(diǎn)[9,11,34]。因此，檢測(cè)和監(jiān)測(cè)玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型，揭示其有性生殖和遺傳變異機(jī)制，對(duì)玉米大斑病和小斑病的長(zhǎng)期可持續(xù)控制具有重要意義。室內(nèi)雜交是玉米大斑病菌和小斑病菌交配型的傳統(tǒng)檢測(cè)方法，該方法需要具備交配親和性高和已知交配型的標(biāo)準(zhǔn)菌株，且從菌株分離純化到獲得理想的雜交檢測(cè)結(jié)果耗時(shí)較長(zhǎng)，不利于變異較快的玉米大斑病菌和小斑病菌大樣本交配型的快速和及時(shí)檢測(cè)。盡管GAFUR等建立了玉米小斑病菌交配型的PCR檢測(cè)方法[35-36]，但是，該方法或缺乏有效的靈敏性和特異性檢驗(yàn)或操作步驟較為繁瑣。因此，本研究分別建立了玉米大斑病菌和小斑病菌交配型的多重PCR檢測(cè)方法，該方法具有更加快速、靈敏、準(zhǔn)確、特異、可靠以及操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，適合大樣本交配型的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)。

多重PCR是在一個(gè)反應(yīng)體系里加入2對(duì)及以上引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系較為復(fù)雜，受諸多內(nèi)外因素的影響[37]。特異引物設(shè)計(jì)的成功與否直接決定了多重PCR檢測(cè)的成敗。本研究利用已報(bào)道的玉米大斑病菌和小斑病菌交配型基因進(jìn)行序列多重比對(duì)，在各保守區(qū)設(shè)計(jì)和篩選出錯(cuò)配率低、退火溫度一致、擴(kuò)增產(chǎn)物大小合適的4對(duì)交配型檢測(cè)特異引物，引物經(jīng)NCBI網(wǎng)站的Primer-BLAST在線工具進(jìn)行特異性驗(yàn)證，最終分別成功建立了玉米大斑病菌和小斑病菌交配型的多重PCR檢測(cè)方法。優(yōu)化多重PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件是獲得理想擴(kuò)增結(jié)果的前提。本研究針對(duì)影響多重PCR擴(kuò)增結(jié)果的重要參數(shù)，如引物的退火溫度、擴(kuò)增的延伸時(shí)間以及擴(kuò)增循環(huán)數(shù)等分別進(jìn)行單因素3—8個(gè)水平的系統(tǒng)優(yōu)化，結(jié)果表明，引物的退火溫度、擴(kuò)增的延伸時(shí)間以及擴(kuò)增循環(huán)數(shù)均對(duì)多重PCR反應(yīng)體系有明顯影響。其中特異引物的退火溫度是決定實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵因素，一般退火溫度越低，擴(kuò)增的條帶模糊、特異性低；退火溫度越高，不利于大片段的擴(kuò)增。因此，本研究通過梯度PCR擴(kuò)增優(yōu)化出玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR檢測(cè)引物的最佳退火溫度分別為57.2℃和55.0℃。盡管本研究未對(duì)多重PCR反應(yīng)體系中Taq聚合酶用量、dNTPs濃度、Mg2+濃度以及模板DNA濃度進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化，但是根據(jù)預(yù)混液的推薦劑量進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增也能獲得理想的結(jié)果，表明本研究建立的玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR檢測(cè)方法的適用性較好。

表3 不同地理來源的玉米大斑病菌和小斑病菌交配型的多重PCR和雜交檢測(cè)

a括號(hào)內(nèi)數(shù)字表示隨機(jī)抽取用于雜交實(shí)驗(yàn)的菌株數(shù)The number in parentheses represents the number of strains which were randomly selected for cross assays；b“+”：多重PCR方法成功檢測(cè)出所有待測(cè)菌株的交配型Mating types of all tested strains were successfully detected using multiple PCR method；小括號(hào)內(nèi)數(shù)字表示雜交檢測(cè)出的菌株數(shù)，且與多重PCR檢測(cè)結(jié)果完全一致The number in parentheses indicates the number of strains detected by cross assays, which are completely consistent with the results of multiple PCR detection；ND：未檢測(cè)No detection

理想的交配型PCR檢測(cè)方法應(yīng)具有較高的靈敏度和特異性[36]。多重PCR的靈敏度越高，模板DNA量的需求就越低。本研究建立的玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR檢測(cè)最低靈敏度為0.1 ng基因組DNA，該劑量的模板濃度極易從病原菌的菌絲或分生孢子中通過DNA小劑量提取法獲得[38]，從而降低了對(duì)模板DNA的要求，提高了多重PCR交配型檢測(cè)的成功率。引物的特異性是多重PCR的另一重要因素[36]，本研究建立的玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR檢測(cè)方法不僅能夠很好地區(qū)分玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型，而且能夠分別從其相應(yīng)的和近緣種和其他14個(gè)屬種間區(qū)分開來，避免了由于近緣種干擾而產(chǎn)生的假陽(yáng)性，提高了多重PCR交配型檢測(cè)的準(zhǔn)確性。此外，由于本研究建立的玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR檢測(cè)方法具有較高的靈敏度和特異性，能夠分別將其從相應(yīng)的近緣種和其他屬種區(qū)分來（圖4），因此，該多重PCR檢測(cè)體系還可以用于玉米大斑病和小斑病的田間早期快速診斷和病害的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)，為有效預(yù)防和控制玉米大斑病和小斑病，保障玉米安全優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)提供了技術(shù)支持。

通過建立的玉米大斑病菌和小斑病菌交配型多重PCR檢測(cè)方法分別對(duì)來自福建、安徽、浙江、廣東和海南省的129和194株玉米大斑病菌和小斑病菌的交配型進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示兩種病原菌的交配型檢測(cè)成功率均為100%，且多重PCR檢測(cè)結(jié)果與雜交驗(yàn)證結(jié)果吻合，表明該檢測(cè)方法準(zhǔn)確性高、可靠性好。通過交配型檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，不同省份或地區(qū)的玉米大斑病菌和小斑病菌均同時(shí)存在MAT1-1和MAT1-2兩種交配型，所有菌株均為無性態(tài)菌株，未檢測(cè)到有性態(tài)菌株。該研究結(jié)果與郭建國(guó)等均檢測(cè)到玉米大斑病菌田間有性態(tài)菌株的結(jié)果不一致[12,39-40]。本研究未檢測(cè)到有性態(tài)菌株，說明上述采集地田間菌株發(fā)生有性生殖的風(fēng)險(xiǎn)性較低。但是，不同交配型菌株的同時(shí)存在，增加了有性重組的可能性，暗示未來病菌群體的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性可能發(fā)生更加復(fù)雜的變化。因此，將來工作的重點(diǎn)應(yīng)該是加強(qiáng)對(duì)玉米大斑病菌和小斑病菌田間交配型、群體遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性的監(jiān)測(cè)以及病原菌遺傳變異機(jī)制的深入研究。

4 結(jié)論

通過設(shè)計(jì)交配型檢測(cè)特異引物并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，分別建立了玉米大斑病菌和小斑病菌交配型的多重PCR檢測(cè)方法。該方法具有靈敏度高、特異性好和操作簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)出玉米大斑病菌和小斑病菌MAT1-1和MAT1-2兩種交配型，為玉米大斑病菌和小斑病菌交配型的田間分布和監(jiān)測(cè)以及有性遺傳研究提供了可靠的技術(shù)方法。

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Establishment and Application of a Multiple PCR Method to Detect Mating Types ofand

DAI YuLi1, GAN Lin1, TENG ZhenYong2, YANG JingMin3, QI YueYue4, SHI NiuNiu1, CHEN FuRu1, YANG XiuJuan1

(1Institute of Plant Protection, Fujian Academy of Agricultural Sciences/Fujian Key Laboratory for Monitoring and Integrated Management of Crop Pests, Fuzhou 350013;2Fujian Seed Management Station, Fuzhou 350001;3Jianou Municipal Bureau of Agriculture and Rural Affairs, Jianou 353100, Fujian;4Zhejiang Tianfeng Biological Science Co. Ltd, Jinhua 321000, Zhejiang)

【Objective】Northern corn leaf blight (NCLB) and southern corn leaf blight (SCLB), caused byand, respectively, are the most important foliar fungal diseases affecting maize production. The objective of this study is to establish a multiple PCR method to detect mating types ofand, and to provide a technical method for the study of mating type distribution in the field and sexual reproduction ofand.【Method】Mating type-specific primers for the two pathogens were designed on the basis of mating type gene sequences of(accession numbers: GU997138 for MAT1-1; GU997137 for MAT1-2) and(accession numbers: X68399 for MAT1-1; X68398 for MAT1-2) obtained from GenBank, and the important parameters of primer annealing temperatures, extension times and amplification cycles in the amplification program were optimized using the single factor method. A multiple PCR method was established to detect mating types ofand, and the sensitivity and specificity of the multiple PCR were also assessed. Meanwhile, the mating types of 129 strains ofand 194 strains offrom field-collections were detected by the multiple PCR to determine the adaptability of the established method.【Result】The expected 816, 132 bp (), and 490, 136 bp () target fragments were amplified specifically using the multiple PCR with mating type-specific primers of StMAT01-2F/R, StMAT02-3F/R, and ChMAT01-3F/R, ChMAT02-2F/R from MAT1-1 and MAT1-2 strains, respectively. A 25 μL PCR reaction system consisted of 12.5 μL 2×Multiplex PCR Mix, 10 pmol each primer, and 100 ng DNA template. The annealing temperatures forandwere 57.2℃ and 55.0℃, respectively, and the number of amplification cycles was 35. The multiple PCR method could reliably detect mating types ofat 0.1 ng genomic DNA for MAT1-1 or 0.01 ng DNA for MAT1-2 from single-spore strains, while the sensitivity of the multiple PCR to detect mating types ofwas 0.1 ng genomic DNA for both MAT1-1 and MAT1-2 from pure culture strains. The method exhibited specificity in differentiating mating types ofandfrom their closely-related species, as well as 14 other fungal genera. The results of mating types detection ofandstrains from different geographical origins indicated that the multiple PCR could reliably detect mating types of 129 and 194 strains ofand, respectively. These results were consistent with the verification results of laboratorial cross assays with random selected strains from different locations.【Conclusion】The established multiple PCR method for mating types detection ofandin this study was characterized as high sensitivity, specificity and user-friendly control, it could accurately and rapidly detect mating types ofand. This study provides a reliable technique and approach for the study of distribution and monitoring of mating types in the field and sexual reproduction ofand.

;; mating type; multiple PCR; sensitivity; specificity

2019-08-13；

2019-09-18

福建省屬公益類科研院所專項(xiàng)（2017R1025-3，2018R1025-1）、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD0200706）、福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年自由探索項(xiàng)目（AA2018-14）、福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科技英才百人計(jì)劃（YC2016-4）、福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（STIT2017-1-8）

代玉立，E-mail：dai841225@126.com。通信作者楊秀娟，E-mail：yxjzb@126.com

（責(zé)任編輯 岳梅）