食管鱗狀細胞癌中環(huán)狀RNA的生物學(xué)功能與調(diào)控機制研究

胡增濤，王微娜，孫東升，關(guān)滄海，姜興明

管癌的發(fā)病率位居所有惡性腫瘤第八位，高發(fā)地區(qū)包括亞洲中部、伊朗與中國北部，按照組織學(xué)類型可分為鱗狀細胞癌和腺癌[1-2]。食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)占我國食管癌的95%以上，位居癌癥相關(guān)死亡原因第四位[3-4]。ESCC的高病死率主要是由于疾病早期診斷率低及確診時約50%患者已發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移[5-6]。臨床數(shù)據(jù)表明，ESCC晚期患者5年生存率低于20%，故早期診斷及治療能顯著改善ESCC患者預(yù)后，且術(shù)后10年生存率可達95%[7-11]。因此，尋找可行的早期篩查指標對于ESCC的診治極為重要。有研究發(fā)現(xiàn)，相比于正常食管組織，ESCC中環(huán)狀RNA(circular RNA, circRNA)存在顯著性差異表達，參與調(diào)控ESCC的發(fā)生、發(fā)展，并且circRNA還與ESCC放療敏感度及預(yù)后密切相關(guān)[12-17]。本文就ESCC中circRNA的生物學(xué)功能與調(diào)控機制進行闡述，為疾病的診斷與治療提供新的思路。

1 circRNA概述

在20世紀70年代，Sanger等[18]通過電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)類病毒是具有共價閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)與高熱穩(wěn)定性的單鏈RNA分子，亦是研究人員首次發(fā)現(xiàn)circRNA。最初研究人員認為circRNA僅在少數(shù)細胞中以低水平表達，但隨著RNA測序與生物信息學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)circRNA因其結(jié)構(gòu)特性不受RNA外切酶作用，能夠在哺乳動物細胞中穩(wěn)定、保守地表達，具有細胞表型特異性及組織和發(fā)育階段特異性[19-20]。此外，circRNA參與調(diào)控包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，其主要生物學(xué)功能是充當微小RNA(miRNA)海綿、調(diào)節(jié)親本基因轉(zhuǎn)錄及作為調(diào)控性蛋白質(zhì)與編碼性蛋白質(zhì)相互作用的銜接子[21-23]。

2 ESCC中促癌功能circRNA

2.1CDR1反義RNA(CDR1 antisense RNA, ciRS)-7 Sang等[24]應(yīng)用實時定量PCR(quantitative real time PCR, qRT-PCR)對86例ESCC標本與正常標本進行檢測，發(fā)現(xiàn)ESCC中ciRS-7呈異常高表達，并且表達水平與病理分級和臨床分期密切相關(guān)，同時集落形成實驗、劃痕實驗及Transwell實驗均顯示ciRS-7過表達能夠促進ESCC細胞增殖、侵襲及遷移，與孟令嬌等[25]研究結(jié)果一致。此外，Sang等[24]熒光素酶實驗結(jié)果表明，ciRS-7與miR-876-5p、miR-876-5p及MAGE-A家族基因之間均存在結(jié)合位點，且外源性上調(diào)miR-876-5p表達能夠抑制腫瘤細胞增殖、降低侵襲遷移能力、下調(diào)MAGE-A家族基因的表達，而ciRS-7過表達則能逆轉(zhuǎn)上述抑制作用，同時MAGE-A家族基因表達上調(diào)能夠促進ESCC細胞增殖與遷移；動物實驗結(jié)果顯示，ciRS-7過表達能夠促進腫瘤生長并逆轉(zhuǎn)miR-876-5p對ESCC惡性進展的抑制作用；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，miR-876-5p過表達組MAGE-A蛋白與增殖標志物的表達降低，而這種負向調(diào)控作用又受ciRS-7的抑制。

Li等[26]研究發(fā)現(xiàn)ciRS-7在ESCC組織中過表達，并且其表達水平可作為預(yù)后獨立影響因素。有文獻報道，ciRS-7能夠內(nèi)源性海綿吸附miR-7，而miR-7與HOXB13的3'-UTR中的互補序列相結(jié)合以下調(diào)其表達水平[27-28]，且過表達miR-7能夠抑制腫瘤細胞增殖、侵襲與遷移，誘導(dǎo)HOXB13表達水平顯著下調(diào)，同時miR-7的抑制作用均能通過重新引入ciRS-7來逆轉(zhuǎn)。有研究表明，NF-κB信號通路的激活參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并且與HOXB13促進前列腺癌細胞轉(zhuǎn)移及肺癌中ciRS-7促癌作用的發(fā)揮密切相關(guān)，同時過表達的HOXB13能夠促進ESCC中p65磷酸化[29-30]。上述研究說明ciRS-7的上調(diào)能夠消除miR-7對其下游靶基因HOXB13的抑制作用，誘導(dǎo)p65磷酸化，從而促進ESCC的惡性生物學(xué)行為。此外，有研究發(fā)現(xiàn)ciRS-7能夠通過miR-7/KLF4分子軸上調(diào)磷酸化IKK-α的表達，進而推動ESCC的惡性進展[31]。

2.2環(huán)狀RNA蛋白激酶C(circular RNA protein kinase C iota, circ-PRKCI) circ-PRKCI在ESCC中過表達，并且外源性上調(diào)circ-PRKCI表達能夠促進腫瘤細胞的增殖與遷移[32]。核質(zhì)分離實驗結(jié)果表明circ-PRKCI主要位于胞質(zhì)，提示circ-PRKCI可能參與介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后修飾；生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果顯示，circ-PRKCI能夠與miR-3680-3p結(jié)合，且miR-3680-3p在同一個位點與AKT絲氨酸/蘇氨酸激酶3(AKT serine/threonine kinase 3, AKT3)存在合作關(guān)系；進一步研究發(fā)現(xiàn)ESCC中miR-3680-3p表達水平下降，AKT3表達水平上調(diào)，同時circ-PRKCI能夠逆轉(zhuǎn)miR-3680-3p mimics對ESCC細胞增殖、遷移及AKT3表達的抑制作用[32]。此外，Xia等[33]研究表明circ-PRKCI在ESCC中呈過表達(相比對照組平均上調(diào)8.75倍)，并且表達水平與腫瘤分化及TNM分期密切相關(guān)；CCK-8測定、集落形成實驗與Transwell實驗結(jié)果顯示，降低circ-PRKCI表達能夠顯著抑制ECA-109與TE-13腫瘤細胞的增殖與侵襲遷移能力，且利用siRNA轉(zhuǎn)染ECA-109與TE-13腫瘤細胞后能夠下調(diào)Cyclin D的表達并誘導(dǎo)細胞周期停滯于G2期。

2.3circRNA_100876 Cao等[34]發(fā)現(xiàn)circRNA_100876在ESCC中的表達水平明顯高于相鄰正常組織，并且與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血管侵襲密切相關(guān)；動物體內(nèi)成瘤實驗結(jié)果證實siRNA轉(zhuǎn)染組小鼠腫瘤體積明顯小于對照組；細胞實驗結(jié)果顯示，外源性敲除circRNA_100876能夠在體外抑制ESCC細胞的增殖、侵襲及遷移，下調(diào)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白與轉(zhuǎn)錄因子的表達，誘導(dǎo)細胞周期停滯于G2/M期并促進其凋亡。

2.4其他circRNA Rong等[35]應(yīng)用qRT-PCR對ESCC患者和健康者的血漿及ESCC患者腫瘤組織進行檢測，發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA MAGUK支架蛋白1(circular RNA discs large MAGUK scaffold protein 1, circ-DLG1)表達水平顯著上調(diào)，并且與TNM分期密切相關(guān)；CCK-8測定與集落形成實驗結(jié)果表明，利用siRNA轉(zhuǎn)染circ-DLG1高表達的K180和T10細胞能夠有效抑制ESCC細胞增殖。Wang等[36]通過對ESCC患者及正常受試者血漿進行微陣列分析，發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA四肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域17(circular RNA tetratricopeptide repeat domain 17, circ-TTC17)的差異表達最為顯著，同時ESCC中circ-TTC17呈過表達，并且其表達水平與TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；細胞實驗結(jié)果顯示，外源性下調(diào)circ-TTC17的表達水平能夠抑制腫瘤的增殖與遷移。Song等[37]研究發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0000337在ESCC中的表達水平顯著上調(diào)；動物實驗結(jié)果表明外源性敲除hsa_circ_0000337能夠抑制腫瘤細胞增殖與侵襲，促進腫瘤細胞凋亡；熒光素酶實驗結(jié)果顯示，hsa_circ_0000337與miR-670-5p存在結(jié)合位點。上述研究表明circRNA在ESCC中的下游靶基因與功能蛋白尚未明確，并且具體作用機制有待深入研究。

3 ESCC中抑癌功能circRNA

3.1環(huán)狀RNA E3泛素蛋白連接酶(circular RNA itchy E3 ubiquitin protein ligase, circ-ITCH) 有研究發(fā)現(xiàn)，與相鄰正常組織比較，circ-ITCH在ESCC中表達水平顯著下調(diào)；皮下成瘤實驗、CCK-8測定與集落形成實驗結(jié)果表明，過表達circ-ITCH能夠在體內(nèi)與體外顯著抑制腫瘤細胞的增殖；流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，circ-ITCH表達水平上調(diào)能夠誘導(dǎo)ESCC細胞周期停滯于G1期；對circ-ITCH作用機制進行研究，發(fā)現(xiàn)其通過充當“分子海綿”與相應(yīng)miRNA結(jié)合，進而上調(diào)下游基因E3泛素蛋白連接酶(itchy E3 ubiquitin protein ligase, ITCH)的表達，而ITCH的過表達能夠促進蓬亂蛋白2的泛素化與降解、抑制T淋巴細胞特異轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性并下調(diào)腫瘤細胞中c-Myc與β-catenin的表達[38]。上述研究表明circ-ITCH通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑在ESCC中發(fā)揮抗腫瘤作用。

3.2circ0043898 Wang等[39]應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)與qRT-PCR對ESCC標本織進行檢測，發(fā)現(xiàn)差異表達的circRNA主要參與腫瘤蛋白多糖的合成及Rap1與mTOR信號通路，其中circ0043898在腫瘤組織中的表達水平較為穩(wěn)定且明顯低于正常組織；動物實驗結(jié)果證實，circ0043898過表達組腫瘤的體積更小、重量更輕；MTS測定與集落形成實驗結(jié)果顯示，應(yīng)用circ0043898過表達載體轉(zhuǎn)染Kyse-520與ECA-109細胞后能夠顯著抑制其增殖能力；Transwell實驗結(jié)果表明，外源性上調(diào)circ0043898表達能抑制腫瘤細胞侵襲與遷移，并且Kyse-520與ECA-109細胞凋亡百分比分別增加2倍和4倍，同時使細胞周期停滯于G1期。

3.3環(huán)狀RNA SMAD家族成員7(circular RNA SMAD family member 7, circ-SMAD7) Zhang等[40]通過對ESCC患者及健康對照組血漿進行微陣列分析與qRT-PCR檢測，證實circ-SMAD7在ESCC中表達水平顯著下調(diào)，并且與TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)，同時ESCC腫瘤細胞系TE10和KYSE30的circ-SMAD7表達水平最低；集落形成實驗結(jié)果顯示，外源性下調(diào)E10和KYSE30細胞中circ-SMAD7的表達能夠促進腫瘤細胞增殖，而E10和KYSE30細胞內(nèi)轉(zhuǎn)染circ-SMAD7過表達載體則能夠抑制腫瘤生長；傷口愈合測定實驗結(jié)果表明，circ-SMAD7表達受抑制的ESCC細胞相較于健康對照組可表現(xiàn)出更高的遷移率，而circ-SMAD7過表達則能夠抑制ESCC細胞遷移。

4 展望

從錯誤剪接的副產(chǎn)物到具有重要生物學(xué)功能的RNA分子，circRNA的功能隨著研究的深入不斷地被發(fā)掘。作為穩(wěn)定、保守的非編碼RNA，circRNA可作為腫瘤診斷標志物、治療靶點及預(yù)后評估指標。目前我國ESCC發(fā)病率仍位于世界前列，ESCC中circRNA的研究對于臨床診治及預(yù)后評價具有重要意義。此外，circRNA在ESCC中的作用機制尚未闡明，其生物學(xué)功能的研究仍主要圍繞于“分子海綿”機制，相信隨著相關(guān)機制的進一步發(fā)現(xiàn)與闡明，circRNA有望作為新型生物學(xué)標志物在ESCC的篩查、診斷與治療中獲得更為廣泛的應(yīng)用。