李換麗，王丹，張樹偉，雷佳，吳霞，王新勝，馬燕斌

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，山西運(yùn)城044000）

大豆（Glycine max L.Merrill）是我國主要的糧油作物，在國民經(jīng)濟(jì)中占有重要的地位[1]，同時(shí)它也是我國主要的栽培作物[2]。但是由于外界生物脅迫（病蟲害）[3]、非生物脅迫（干旱、鹽堿、重金屬）[4-5]等環(huán)境的不利影響，致使自主育種的大豆產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降，不能滿足國內(nèi)消費(fèi)者的需求[6]。短時(shí)間內(nèi)，我國大豆需求主要還是依靠進(jìn)口，培育優(yōu)質(zhì)大豆品種迫在眉睫[7]。而山西由于獨(dú)特的地理優(yōu)勢(shì)被稱為小雜糧之國，大豆作為其中的一種主要作物，其產(chǎn)量低、抗病性差等缺點(diǎn)限制了大豆育種的進(jìn)程[8]。2019年，國家大力開展大豆振興計(jì)劃。然而常規(guī)育種方法周期長(zhǎng)，且有一定的局限性。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)改善大豆品質(zhì)是目前的有效途徑，它具有縮短育種周期、效率高等優(yōu)點(diǎn)[9-10]。利用大豆遺傳高效的轉(zhuǎn)化體系和再生技術(shù)進(jìn)行遺傳改良是轉(zhuǎn)基因大豆的主要措施。最早關(guān)于大豆遺傳轉(zhuǎn)化的外植體是由CHENG等[11]研究報(bào)道，于1980年通過子葉節(jié)再生體系成功獲得再生植株。此后，如下胚軸、胚尖、未成熟的種子等不定芽器官發(fā)生系統(tǒng)被相繼報(bào)道[12-13]。其中，子葉節(jié)和胚尖再生體系是目前在大豆遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中應(yīng)用最多的外植體，但是由于受體遺傳背景的限制，轉(zhuǎn)化效率和再生率差別很大，能夠進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的材料非常少，造成大豆在遺傳轉(zhuǎn)化中依然存在許多困難[14]，因此，選擇再生能力強(qiáng)的基因型是大豆遺傳轉(zhuǎn)化的首選條件。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，不同大豆由于遺傳背景的差異使不定芽器官誘導(dǎo)結(jié)果不同。首先，表現(xiàn)為不同品種大豆在同種再生體系中的再生率不同[15-17]。其次，相同大豆在不同的再生體系中再生率存在很大差異。研究發(fā)現(xiàn)，合豐46號(hào)在胚尖再生體系中的再生率明顯優(yōu)于子葉節(jié)體系[18]，黑農(nóng)51號(hào)在子葉節(jié)再生體系中的各個(gè)指標(biāo)均高于胚尖體系[19]，黑農(nóng)37號(hào)在胚尖再生體系中的不定芽誘導(dǎo)率、伸長(zhǎng)率及個(gè)數(shù)均明顯高于子葉節(jié)再生體系[18，20]。而對(duì)于山西省的主栽品種再生能力未見報(bào)道。

本試驗(yàn)選取10個(gè)大豆品種進(jìn)行再生體系的研究，通過比較不同大豆在子葉節(jié)和胚尖再生體系中不定芽誘導(dǎo)率、伸長(zhǎng)率、生根率及再生苗成活率等參數(shù)的差異，以期選擇再生能力強(qiáng)的品種及適合的外植體，為后期山西的大豆遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所采用的大豆分別是晉豆25號(hào)、晉遺30號(hào)、晉遺31號(hào)、晉科4號(hào)、晉科2號(hào)、邯豆5號(hào)、中黃13號(hào)、晉豆19號(hào)、晉豆36號(hào)和晉豆37號(hào)，總共10個(gè)品種。其中，中黃13號(hào)為對(duì)照。試驗(yàn)材料均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所、經(jīng)濟(jì)作物研究所和農(nóng)作物品種資源研究所提供。

試驗(yàn)利用子葉節(jié)培養(yǎng)基（表1）和胚尖培養(yǎng)基（表2）2種途徑進(jìn)行再生株誘導(dǎo)。其中，所用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基需經(jīng)過121℃高壓滅菌20 min，冷凝后備用。然后將激素加入（激素需通過過濾器除菌后），混勻，備用。

表1 子葉節(jié)再生體系的培養(yǎng)基

表2 胚尖再生體系的培養(yǎng)基

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子消毒采用過氧化氫消毒法。選取表面干凈、大小一致的大豆種子于通風(fēng)處，用無菌水洗凈后浸泡3 min，再用75%酒精浸泡5 min，最后用15%過氧化氫消毒90 min，期間在搖床進(jìn)行，獲得無菌種子。

1.2.2 外植體的獲得子葉節(jié)獲取參考MA等[21]的方法，并稍做改動(dòng)。將獲得的無菌種子在無菌水中浸泡16～18 h，然后去除種皮，接種在發(fā)芽培養(yǎng)基上1～7 d，獲得無菌苗，期間培養(yǎng)溫度24℃。去掉大豆無菌苗的頂芽和腋芽并切掉下胚軸，留有3 mm左右的下胚軸與子葉相連的部位即可，沿子葉節(jié)縱向切開備用，同時(shí)在子葉節(jié)部位縱向劃3～5刀，切去1/3子葉，獲得子葉節(jié)外植體。其中，試驗(yàn)分別選取萌發(fā)1、3、5、7 d的外植體進(jìn)行研究。每個(gè)外植體100粒，5次重復(fù)。

胚尖獲取參考LIU等[13]的方法。將獲得的無菌種子在無菌水中浸泡16～18 h，去除種皮，去掉子葉和原葉，分離得到胚尖外植體。

1.2.3 不定芽誘導(dǎo)及伸長(zhǎng)子葉節(jié)誘導(dǎo)時(shí)將外植體斜插45°接種在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，待子葉節(jié)部位長(zhǎng)出不定芽，統(tǒng)計(jì)芽誘導(dǎo)數(shù)及誘導(dǎo)率；然后將其接種在子葉節(jié)再生體系的芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上，當(dāng)芽長(zhǎng)2～3 cm時(shí)，統(tǒng)計(jì)芽伸長(zhǎng)率。胚尖誘導(dǎo)時(shí)將胚尖朝上，接種在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，統(tǒng)計(jì)芽誘導(dǎo)數(shù)及誘導(dǎo)率；然后切去胚尖的褐色基部，繼續(xù)接種在胚尖再生體系的芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基上，當(dāng)芽長(zhǎng)2～3 cm時(shí)，統(tǒng)計(jì)芽伸長(zhǎng)率。

試驗(yàn)過程中將子葉節(jié)和胚尖芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基置于光照16 h，黑暗8 h，白天溫度25℃左右，夜晚22℃的培養(yǎng)間培養(yǎng)。

1.2.4 不定根的誘導(dǎo)及再生植株形成待芽長(zhǎng)出2～3 cm時(shí)，將其接種在生根培養(yǎng)基上15 d，待其長(zhǎng)出主根，進(jìn)而獲得子葉節(jié)再生苗，統(tǒng)計(jì)生根率。獲得再生苗后，打開組培瓶蓋煉苗3 d，然后移入滅菌的蛭石土花盆中，用薄的塑料膜密封保濕，成活后收種子，統(tǒng)計(jì)再生苗的成活率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同萌發(fā)時(shí)間對(duì)大豆子葉節(jié)再生體系中不定芽誘導(dǎo)數(shù)的分析

通過對(duì)10個(gè)不同大豆品種不同萌發(fā)時(shí)間的外植體進(jìn)行子葉節(jié)再生體系的研究，結(jié)果表明，大豆的萌發(fā)狀態(tài)影響后期再生體系的不定芽誘導(dǎo)數(shù)。由圖1可知，除中黃13號(hào)外，其他大豆品種都是隨萌發(fā)時(shí)間延長(zhǎng)，子葉節(jié)再生體系的不定芽誘導(dǎo)數(shù)增多，在萌發(fā)5 d時(shí)達(dá)到最高峰，而后隨萌發(fā)時(shí)間延長(zhǎng)，不定芽誘導(dǎo)數(shù)下降。而中黃13號(hào)在萌發(fā)第5天未達(dá)到最大值。通過比較不同大豆品種在不同萌發(fā)時(shí)間的外植體的不定芽數(shù)發(fā)現(xiàn)，中黃13號(hào)在萌發(fā)第7天不定芽誘導(dǎo)數(shù)較其他萌發(fā)時(shí)間多，為74個(gè)。其他品種都是在萌發(fā)第5天達(dá)到最多。不定芽誘導(dǎo)數(shù)在一定程度上反映了此大豆品種的再生能力。因此，后期需要以萌發(fā)第7天的中黃13號(hào)外植體萌發(fā)狀態(tài)和萌發(fā)第5天的其他品種大豆外植體狀態(tài)進(jìn)行研究。

2.2 不同大豆品種在不同再生體系中不定芽誘導(dǎo)數(shù)的比較分析

表3 不同大豆品種在不同再生體系中芽誘導(dǎo)數(shù)的比較

通過不同大豆品種在不同再生體系中不定芽誘導(dǎo)數(shù)的比較發(fā)現(xiàn)，品種和再生體系都能夠影響大豆的再生能力和不定芽誘導(dǎo)數(shù)。由表3可知，在子葉節(jié)再生體系中的不同品種大豆的不定芽誘導(dǎo)數(shù)不同，且差異達(dá)到顯著水平。其中，晉豆25號(hào)不定芽誘導(dǎo)數(shù)最少，為22.6個(gè)；晉豆37號(hào)不定芽誘導(dǎo)數(shù)最多，為183.0個(gè)。介于中間的不定芽誘導(dǎo)數(shù)由少到多依次為：晉遺30號(hào)、晉遺31號(hào)、晉科4號(hào)、晉科2號(hào)、邯豆5號(hào)、晉豆19號(hào)、晉豆36號(hào)、中黃13號(hào)。通過不同大豆品種在胚尖再生體系中比較分析發(fā)現(xiàn)，不定芽誘導(dǎo)數(shù)不同且差異顯著。其中，晉遺31號(hào)不定芽誘導(dǎo)數(shù)最少，為35.4個(gè)；晉豆36號(hào)不定芽誘導(dǎo)數(shù)最多，為184.2個(gè)。中間不定芽誘導(dǎo)數(shù)由少到多依次為：晉豆25號(hào)、晉遺30號(hào)、晉科4號(hào)、晉科2號(hào)、晉豆19號(hào)、邯豆5號(hào)、晉豆37號(hào)、中黃13號(hào)。

從表3還可以看出，晉豆25號(hào)、晉遺30號(hào)、晉遺31號(hào)、晉科4號(hào)和晉科2號(hào)不定芽誘導(dǎo)數(shù)在2種再生體系中均未達(dá)到1/2，其再生能力較差。而晉豆19號(hào)、晉豆36號(hào)、中黃13號(hào)和晉豆37號(hào)在2種再生體系中的不定芽誘導(dǎo)數(shù)超過半數(shù)，芽誘導(dǎo)能力較好。此外，邯豆5號(hào)在胚尖再生體系中的不定芽誘導(dǎo)數(shù)為132個(gè)，但在子葉節(jié)再生體系中為82.4個(gè)，可能較適合在胚尖再生體系中進(jìn)行研究。

因此，最終選擇芽誘導(dǎo)能力較好的5個(gè)大豆品種：晉豆19號(hào)、晉豆36號(hào)、晉豆37號(hào)、中黃13號(hào)和邯豆5號(hào)進(jìn)行后期不同參數(shù)的比較，以便為下一步大豆遺傳轉(zhuǎn)化受體提供參考。

2.3 不同大豆品種在不同再生體系中的參數(shù)研究

從圖2可以看出，不同大豆品種對(duì)子葉節(jié)再生體系和胚尖再生體系中不定芽誘導(dǎo)率、不定芽伸長(zhǎng)率、生根率及再生苗成活率的影響存在差異。

通過子葉節(jié)再生體系不同大豆品種試驗(yàn)，結(jié)果表明，晉豆37號(hào)芽再生率最高，為91.5%，中黃13號(hào)雖然不定芽誘導(dǎo)率（90.6%）小于晉豆37號(hào)，但二者沒有明顯差異。晉豆36號(hào)誘導(dǎo)率比中黃13號(hào)小且差異顯著。邯豆5號(hào)誘導(dǎo)率最低。而伸長(zhǎng)率最多的同樣是晉豆37號(hào)，其次是中黃13號(hào)，最低的為邯豆5號(hào)。生根率由大到小依次是：晉豆37號(hào)、中黃13號(hào)、晉豆36號(hào)、晉豆19號(hào)和邯豆5號(hào)。再生苗成活率的變化趨勢(shì)和伸長(zhǎng)率一致。芽誘導(dǎo)率高的受體材料其伸長(zhǎng)率、生根率及后期再生苗成活率也相對(duì)較高。

胚尖再生體系各個(gè)大豆品種試驗(yàn)結(jié)果表明，晉豆36號(hào)不定芽誘導(dǎo)率最高，為92.1%，其次為中黃13號(hào)，芽誘導(dǎo)率最少的是晉豆19號(hào)。不定芽伸長(zhǎng)率的變化趨勢(shì)和誘導(dǎo)率一致。再生苗生根率最高的為晉豆36號(hào)，而晉豆37號(hào)最少。再生苗成活率由大到小依次為：晉豆36號(hào)、中黃13號(hào)、邯豆5號(hào)、晉豆19號(hào)、晉豆37號(hào)。由4個(gè)統(tǒng)計(jì)指標(biāo)可知，晉豆36號(hào)的不定芽誘導(dǎo)率、不定芽伸長(zhǎng)率、生根率及再生苗成活率均高于其他大豆品種，且差異顯著，而中黃13號(hào)次之。晉豆37號(hào)的不定芽誘導(dǎo)率、不定芽伸長(zhǎng)率雖比邯豆5號(hào)的高，但生根率和再生苗成活率卻明顯低于邯豆5號(hào)。

相同大豆品種在2種再生體系中不定芽誘導(dǎo)率、不定芽伸長(zhǎng)率、生根率及再生苗成活率不同。其中，邯豆5號(hào)、晉豆19號(hào)、晉豆36號(hào)在子葉節(jié)再生體系中的4個(gè)統(tǒng)計(jì)指標(biāo)值均明顯低于胚尖體系，因此，較適合用于胚尖再生體系的研究。中黃13號(hào)與晉豆37號(hào)在子葉節(jié)再生體系中的各項(xiàng)數(shù)值均比在胚尖體系中的高，其較適合用于子葉節(jié)再生體系的研究。

3 結(jié)論與討論

高效的再生轉(zhuǎn)化體系平臺(tái)是大豆遺傳轉(zhuǎn)化所必須的。目前在大豆轉(zhuǎn)化方面仍然存在芽誘導(dǎo)率低、再生率差、重復(fù)率少等缺點(diǎn)。雖然已經(jīng)通過多個(gè)大豆材料進(jìn)行試驗(yàn)研究，但是用于高效遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料仍需要進(jìn)一步挖掘，其穩(wěn)定性仍有待提高。

前期研究發(fā)現(xiàn)，適合子葉節(jié)再生體系且用于再生體系研究的大豆品種主要有：黑農(nóng)51號(hào)、合豐25號(hào)、合豐35號(hào)、黑農(nóng)40、中黃13號(hào)等[19，22-23]，適合胚尖再生體系的品種有：黑農(nóng)37號(hào)、北京小粒豆等[17]。但是關(guān)于其他品種研究甚少。對(duì)于山西境內(nèi)栽培的品種更是未見報(bào)道。除中黃13號(hào)外，試驗(yàn)選取的其他9個(gè)大豆品種都適宜在山西境內(nèi)種植，中黃13號(hào)適合在北京種植。其中試驗(yàn)選取的中黃13號(hào)和王盧平等[23]的外植體狀態(tài)不同，分別是成熟種子和未成熟種子，但都是在子葉節(jié)再生體系中再生率高。

研究發(fā)現(xiàn)，在大豆子葉節(jié)再生體系的遺傳轉(zhuǎn)化中，外植體的萌發(fā)狀態(tài)能夠影響后期遺傳轉(zhuǎn)化效率。王爽等[9]通過對(duì)萌發(fā)1～5 d的大豆外植體研究發(fā)現(xiàn)，可根據(jù)萌發(fā)狀態(tài)的真葉長(zhǎng)度、下胚軸長(zhǎng)度等指標(biāo)作為標(biāo)準(zhǔn)，用于指導(dǎo)后期大豆遺傳轉(zhuǎn)化的試驗(yàn)研究。YANG等[24]研究發(fā)現(xiàn)，萌發(fā)1 d的子葉節(jié)外植體其遺傳轉(zhuǎn)化效率可提高14.71%。但是由于品種不同，種子活力不同等原因，大豆的萌發(fā)狀態(tài)很難用單一的指標(biāo)進(jìn)行說明，也可通過不同萌發(fā)時(shí)間點(diǎn)的外植體再生體系參數(shù)進(jìn)行補(bǔ)充說明。本試驗(yàn)通過對(duì)10個(gè)大豆品種不同萌發(fā)狀態(tài)的外植體進(jìn)行后期芽誘導(dǎo)數(shù)的研究發(fā)現(xiàn)，同一萌發(fā)時(shí)間的不同品種大豆的子葉節(jié)再生體系中芽誘導(dǎo)數(shù)不同，相同大豆品種的外植體在不同的萌發(fā)狀態(tài)其芽誘導(dǎo)數(shù)也不同。除中黃13號(hào)是在萌發(fā)第7天的外植體再生能力較強(qiáng)外，其他品種都是萌發(fā)第5天的較強(qiáng)于其他時(shí)間點(diǎn)。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同大豆品種在相同再生體系中再生率不同。其中，晉豆37號(hào)與中黃13號(hào)在子葉節(jié)再生體系中不定芽誘導(dǎo)率、伸長(zhǎng)率、生根率及再生苗成活率等參數(shù)明顯高于其他品種，具有較高效的再生率及成活率。而在胚尖再生體系中，晉豆36號(hào)的各項(xiàng)指標(biāo)值均高于其他品種，適合用于后續(xù)試驗(yàn)研究。同一大豆品種在不同的再生體系中表現(xiàn)也不同。邯豆5號(hào)、晉豆19號(hào)、晉豆36號(hào)在子葉節(jié)再生體系中的4個(gè)指標(biāo)數(shù)值均明顯低于在胚尖體系，比較適合胚尖再生體系。中黃13號(hào)和晉豆37號(hào)在子葉節(jié)再生體系中的各項(xiàng)數(shù)值均比在胚尖體系中的高，較適合子葉節(jié)再生體系。針對(duì)出現(xiàn)這樣的差異，可能與選取的外植體不同有關(guān)，子葉節(jié)一般是無菌苗生長(zhǎng)1～7 d后獲取，而胚尖是通過種子滅菌后再浸泡過夜后獲取，其外植體獲取時(shí)間不一致，導(dǎo)致大豆生理活性不同，進(jìn)而影響后期芽誘導(dǎo)的能力不同，且外植體再生能力也可能和不同激素的組合、組培溫度、光照等有關(guān)[25-27]。這些試驗(yàn)結(jié)果可為后期加快山西省大豆遺傳轉(zhuǎn)化提供一定的參考。