不同貯藏溫度對(duì)宰后豬里脊肉乳酸代謝通量的影響

張成云，何興興，龐廣昌，張德權(quán)，張春暉，關(guān)文強(qiáng),*

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193）

鮮肉富含人體所需要的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，特別是動(dòng)物性蛋白質(zhì)，在人們的飲食生活中，肉類食品具有重要地位[1-3]。動(dòng)物屠宰后會(huì)經(jīng)歷僵直、成熟等一系列復(fù)雜的生理生化反應(yīng)，完成從肌肉到食用肉的轉(zhuǎn)變。機(jī)體的生命結(jié)束后，其組織細(xì)胞在一段時(shí)間內(nèi)仍然存活，細(xì)胞中酶系統(tǒng)仍具有活性，可以對(duì)相應(yīng)底物進(jìn)行作用，繼續(xù)其生理代謝活動(dòng)。但由于血液循環(huán)中斷，供氧停止，組織細(xì)胞的呼吸途徑被迫改變，從有氧呼吸變?yōu)闊o(wú)氧呼吸，這時(shí)體內(nèi)的糖酵解途徑（Embden-Meyerhof pathway，EMP）變成了主要供能方式。而EMP產(chǎn)生的乳酸又不能被轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟重新利用，導(dǎo)致大量乳酸積累在肌肉中，最終被運(yùn)送到肌肉纖維外，使宰后胴體的pH值由弱堿性慢慢降到酸性極限值[4-6]。pH值的下降導(dǎo)致宰后肌肉出現(xiàn)僵直狀態(tài)，使得肉的韌性增強(qiáng)、食用度降低，口感香氣也受到影響，使肉的品質(zhì)下降[7]，pH值的變化速率與極限pH值是影響肉品品質(zhì)的關(guān)鍵因素，乳酸的積累是導(dǎo)致pH值下降的主要原因。乳酸是EMP的終產(chǎn)物，該途徑在生物體內(nèi)廣泛存在，被認(rèn)為是對(duì)生物體具有重要意義的中心代謝途徑。因此，乳酸在貯藏保鮮中具有重要作用[8]，而乳酸代謝通量在代謝網(wǎng)絡(luò)途徑中不僅可以反映呼吸代謝的受限情況，還能反映合成代謝的增強(qiáng)情況，進(jìn)而能反映出鮮肉品質(zhì)在貯藏過(guò)程中的變化，因此對(duì)于宰后鮮肉乳酸代謝通量的研究是有意義且有必要的。

研究發(fā)現(xiàn)，溫度是多數(shù)生物體代謝活動(dòng)的重要環(huán)境因子，溫度對(duì)肌肉的成熟進(jìn)程和肉品質(zhì)有重要影響，宰后成熟溫度越低，肉品最終感官品質(zhì)和衛(wèi)生指標(biāo)越好[9-11]。最常見(jiàn)的保鮮方法是將鮮肉冷藏在4 ℃左右，但近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)鮮肉、果蔬和水產(chǎn)品等食品冰溫保鮮的研究也逐漸增多[12-14]，在合適的冰溫區(qū)域能夠?qū)C(jī)體的生理活性降到最低程度，又不損害內(nèi)部結(jié)構(gòu)，還能維持其正常的新陳代謝[15]。王正榮等[16]報(bào)道，雞胸肉在冰溫貯藏下可以將成熟進(jìn)程延緩大約2～6 h；許立興等[17]研究發(fā)現(xiàn)，鴨胸肉在冰溫下貯藏比冷藏能夠更好地延緩其腐敗變質(zhì)，使保鮮期延長(zhǎng)15 d。

近幾年，采用代謝通量分析的方法來(lái)研究乳酸在水果貯藏保鮮中的作用已有很多報(bào)道，王會(huì)松等[18]研究發(fā)現(xiàn)適當(dāng)?shù)馁A藏溫度會(huì)增加乳酸代謝通量，有利于降低甜瓜的呼吸代謝，增強(qiáng)合成代謝，達(dá)到延長(zhǎng)果蔬保鮮的效果；與此同時(shí)，蔡修臻[19]也發(fā)現(xiàn)溫度會(huì)影響乳酸代謝通量的升高或降低，并得出5 ℃是哈密瓜貯藏的最佳溫度，在此溫度下，分解代謝最低，合成代謝最高。但目前關(guān)于宰后肌肉的乳酸代謝通量變化的研究鮮有報(bào)道。而在代謝工程中一種重要的量化分析方法就是代謝通量分析（metabolic flux analysis，MFA），目的是定量分析生物體內(nèi)穩(wěn)態(tài)狀態(tài)下代謝途徑中的通量，獲得生物化學(xué)系統(tǒng)的代謝通量、反應(yīng)速率等量化信息，評(píng)估系統(tǒng)代謝能力和極限[20]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)貯藏不同溫度和不同時(shí)間豬里脊肉乳酸代謝通量的變化情況進(jìn)行研究，旨在尋找宰后鮮肉在貯藏過(guò)程中代謝通量的變化規(guī)律，為進(jìn)一步通過(guò)代謝分析從生理生化方面提高鮮肉品質(zhì)質(zhì)量，延長(zhǎng)鮮肉貯藏期。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大白豬小里脊條購(gòu)自天津肉聯(lián)廠；聚乙烯自封袋購(gòu)自河源市華豐塑膠有限公司。

4-羥乙基哌嗪乙磺酸（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）、1,3-二磷酸甘油酸（1,3-diphosphoglycerate，1,3-BPG）、二羥基苯乙酮（dihydroxyacetophenone，DHAP） 美國(guó)Sigma公司；KCl、MgSO4生工生物工程（上海）股份有限公司；NaCl 天津市化學(xué)試劑供銷公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SBA-40C生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所；FA25勻漿機(jī) 上海FLUKO公司；ME204電子天平梅特勒-托利多（儀器）上海有限公司；GQB-700KB溫度梯度箱 天津捷盛東輝保鮮科技有限公司；TG16-WS臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；Fluoroskan Ascent FL熒光-化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 材料處理

適齡生豬屠宰后立即取出脊椎骨內(nèi)側(cè)的完整條狀嫩肉（小里脊條）共8 條，放入已裝好碎冰的13 L便攜式保溫箱（28 cmh20 cmh25 cm），1 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，及時(shí)剔除表面脂肪、筋膜，分割成質(zhì)量40 g左右的肉塊（6 cmh4 cmh2 cm）共24 塊，裝入標(biāo)記好的蘋果牌5號(hào)食品級(jí)保鮮自封袋（100 mmh140 mm）中，分別放入-1 ℃和4 ℃條件下貯藏。在0.5、2、6、12、24、72、120、168 h取樣，取樣時(shí)采用液氮迅速將樣品凍結(jié)，立即凍存于-80 ℃冰箱備用[4]。

1.3.2 葡萄糖、乳酸和NADH含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取10 g肉樣，冰浴研磨，加入90 mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.86%的生理鹽水，進(jìn)行勻漿（勻漿時(shí)間10 s/次，間隔30 s，連續(xù)3～5 次），并將勻漿好的液體全部移入離心管，用8 000 r/min的轉(zhuǎn)速在設(shè)定溫度為4 ℃條件下離心10 min，取適量離心后的上清液分別移入離心管中，每次取25 μL樣液，采用生物傳感器分析儀分別測(cè)定葡萄糖和乳酸的質(zhì)量濃度，每組取3 個(gè)平行，結(jié)果取平均值。之后分別對(duì)其進(jìn)行時(shí)間微分，以測(cè)定出變化速率（單位：mg/（mLgh）），用于通量的計(jì)算。

NADH含量采用Fluoroskan Ascent FL熒光-化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀，根據(jù)酶偶聯(lián)法的原理進(jìn)行測(cè)定，參考Schaefer等[21]的研究，其反應(yīng)體系為0.25 mmol/L HEPES/EDTA緩沖液、100 mmol/L KCl、10 mmol/L MgSO4、0.4 U/mL GAPDH、0.5 mmol/L DHAP、3 mmol/L 1,3-BPG。

1.3.3 乳酸代謝網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

基于豬肉宰后僵直變化規(guī)律及乳酸代謝途徑，并依據(jù)EMP、三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)和磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，PPP）3 個(gè)重要中心代謝途徑，構(gòu)建如圖1所示的豬肉宰后乳酸代謝通量的網(wǎng)絡(luò)圖（本實(shí)驗(yàn)不考慮涉及范圍以外的代謝途徑，把沒(méi)有分叉的直線反應(yīng)統(tǒng)一合并為一個(gè)反應(yīng)，減少代謝網(wǎng)絡(luò)的反應(yīng)數(shù)目）。

圖 1 豬里脊肉中心代謝網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 1 Central metabolic network of pork tenderloin

1.3.4 乳酸代謝通量的測(cè)定

通過(guò)圖1創(chuàng)建的代謝網(wǎng)絡(luò)可知，共有9 個(gè)未知的代謝速率需要測(cè)定（表1），同時(shí)可以確定在胞內(nèi)的6 個(gè)質(zhì)量平衡方程，具體如表2所示。

假設(shè)中間代謝途徑產(chǎn)生的代謝物在胞內(nèi)均處于一種擬穩(wěn)定的狀態(tài)，那么這6 個(gè)途徑的代謝物沒(méi)有積累，即這6 個(gè)途徑的代謝速率均為0，此時(shí)就有6 個(gè)約束向量可以得到。這時(shí)該系統(tǒng)的自由度F＝3，也就是只需求出3 個(gè)未知量（表3），此方程有唯一解（式（1））。而3 個(gè)所求速率P1、P2和P3分別為葡萄糖、乳酸和NADH的變化速率，均可通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)得，最后通過(guò)計(jì)算方程得到乳酸的代謝通量[22-24]。

表 1 豬里脊肉的中心代謝途徑生化反應(yīng)方程式Table 1 Biochemical reactions involved in central metabolic pathway of pork tenderloin

表 2 豬里脊肉的質(zhì)量平衡方程式Table 2 Metabolic flux model equations of pork tenderloin

表 3 豬里脊肉代謝過(guò)程所需要測(cè)定的代謝物速率的平衡方程Table 3 Rate equations of measurable extracellular metabolites in the metabolism of pork tenderloin

式中：P1、P2和P3分別表示葡萄糖、乳酸和NADH水平的變化速率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010軟件進(jìn)行整理，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同處理組間采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)、不同時(shí)間點(diǎn)的同一處理組間采用F檢驗(yàn)以及Duncan’s多重比較進(jìn)行差異顯著性分析，顯著水平為P＜0.05，采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯藏溫度對(duì)豬里脊肉葡萄糖含量的影響

圖 2 不同貯藏溫度對(duì)豬里脊肉葡萄糖含量的影響Fig. 2 Effect of different storage temperatures on glucose content of pork tenderloin

動(dòng)物宰后糖原是肌肉中的重要能量貯備物質(zhì)。在活體狀態(tài)下，肌糖原（葡萄糖）分解后通過(guò)有氧呼吸形成大量的能量物質(zhì)，供肌肉運(yùn)動(dòng)之用。但在宰后，葡萄糖則通過(guò)無(wú)氧呼吸進(jìn)入EMP生成乳酸來(lái)維持機(jī)體的穩(wěn)定[25-26]。由圖2可知，宰后豬里脊肉在-1 ℃和4 ℃貯藏條件下，葡萄糖含量均先逐漸降低最終趨于穩(wěn)定，于168 h后分別達(dá)到0.40 mg/g和0.35 mg/g，從圖2可以看出，-1 ℃貯藏下的葡萄糖含量明顯高于4 ℃（P＜0.05），且葡萄糖在整個(gè)貯藏過(guò)程中的下降速率低于4 ℃，結(jié)果表明宰后貯藏溫度越低，葡萄糖分解速率越慢，越有利于豬肉的保鮮，與李培迪等[4]的研究結(jié)果一致。

2.2 不同貯藏溫度對(duì)乳酸含量的影響

圖 3 不同貯藏溫度對(duì)豬里脊肉乳酸含量的影響Fig. 3 Effect of different storage temperatures on lactic acid content of pork tenderloin

EMP在生物體內(nèi)廣泛存在，被認(rèn)為是對(duì)生物體具有重要意義的中心代謝途徑，乳酸是動(dòng)物宰后EMP的最終產(chǎn)物,其含量是評(píng)價(jià)無(wú)氧EMP程度與肉品質(zhì)的重要指標(biāo)[27-29]。由圖3可知，宰后豬里脊肉在-1 ℃和4 ℃貯藏條件的乳酸含量均先逐漸增加后緩慢下降，在0.5～12 h貯藏期間4 ℃貯藏下豬里脊肉的乳酸含量高于-1 ℃（P＜0.05），是因?yàn)樵跓o(wú)氧條件下，葡萄糖通過(guò)EMP生成大量乳酸，且溫度越高代謝速率越快，乳酸生成速率越快。在24～120 h貯藏期間豬肉乳酸含量上升，是因?yàn)楹笃贓MP終止，氨基酸蛋白質(zhì)分解導(dǎo)致pH值上升，且微生物也開(kāi)始入侵，因此乳酸含量有所下降；且-1 ℃貯藏組豬肉乳酸含量高于4 ℃貯藏組，是因?yàn)楹笃?1 ℃低溫延緩了乳酸的下降速率。因此，-1 ℃貯藏的保鮮效果要好于4 ℃。由圖2、3可知，乳酸含量與葡萄糖含量的結(jié)果大致呈相反趨勢(shì)，說(shuō)明貯藏過(guò)程中葡萄糖被消耗，乳酸積累。且溫度越低乳酸含量變化速率越慢[30]。

2.3 不同貯藏溫度對(duì)NADH含量的影響

圖 4 不同貯藏溫度對(duì)豬里脊肉NADH含量的影響Fig. 4 Effect of different storage temperatures on NADH content of pork tenderloin

NADH不僅是EMP和細(xì)胞呼吸作用中的主要電子供體，還是EMP中的重要代謝產(chǎn)物。在有氧條件下乳酸在乳酸脫氫酶的作用下結(jié)合NAD+生成丙酮酸和NADH，丙酮酸進(jìn)入TCA循環(huán)。而無(wú)氧條件下丙酮酸在乳酸脫氫酶的作用下發(fā)生脫羧和還原反應(yīng)，其中還原劑是NADH，最終生成乳酸和氧化態(tài)的NAD+，提供了EMP所需要的NAD+，NADH和NAD+在EMP途徑中相互轉(zhuǎn)化，在維持機(jī)體代謝網(wǎng)絡(luò)平衡中起到了重要作用。由圖4可以看出，NADH含量在0.5～12 h貯藏過(guò)程中呈下降趨勢(shì)，與此段時(shí)間乳酸含量趨勢(shì)相反，因?yàn)? ℃貯藏下乳酸含量下降要快于-1 ℃，所以消耗的NADH多，因此在貯藏的0.5～12 h，-1 ℃貯藏下的NADH含量高于4 ℃。說(shuō)明機(jī)體中NADH與乳酸之間存在一定相互關(guān)系，并且溫度的變化會(huì)影響宰后機(jī)體的代謝物的變化。

2.4 不同溫度、不同時(shí)間貯藏下宰后豬里脊肉的乳酸代謝通量

通過(guò)測(cè)定不同溫度、不同時(shí)間貯藏下宰后豬里脊肉組織中葡萄糖、乳酸和NADH含量的變化速率，并通過(guò)平衡方程（表3）求出代謝圖中其他未知變化速率，運(yùn)用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理并進(jìn)行歸一化處理（統(tǒng)一為100），然后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行通量分析，得到4 ℃和-1 ℃貯藏條件下的乳酸代謝通量圖，代謝網(wǎng)絡(luò)屬于有向加權(quán)網(wǎng)，整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)以代謝底物、代謝產(chǎn)物或者中間代謝物為網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)，以實(shí)際的反應(yīng)為邊線，反應(yīng)方向?yàn)榧^的方向，通過(guò)代謝網(wǎng)絡(luò)圖可以清楚地看到每一條代謝途徑的流向和趨勢(shì)，結(jié)果如圖5所示。

圖 5 不同溫度對(duì)豬里脊肉作用所產(chǎn)生的乳酸代謝通量圖Fig. 5 Lactic metabolic flux map of lactic acid in pork tenderloin stored at different temperatures

從圖5中可以看出，根據(jù)構(gòu)建的代謝網(wǎng)絡(luò)圖以及相應(yīng)的速率計(jì)算，可以得到宰后豬里脊肉在不同溫度、不同時(shí)間貯藏下的乳酸代謝網(wǎng)絡(luò)通量變化情況。在不同溫度相同貯藏時(shí)間下的乳酸代謝通量明顯不同，并且在同一溫度下不同貯藏時(shí)間的乳酸代謝通量也明顯不同。溫度的變化使豬酮體中EMP的速率發(fā)生了變化。從圖5可以看出，葡萄糖大多數(shù)進(jìn)入了EMP途徑，說(shuō)明EMP途徑在碳源的代謝上具有重要的作用。從丙酮酸節(jié)點(diǎn)來(lái)看，大部分丙酮酸生成乳酸，很少部分生成AcCoA進(jìn)入TCA循環(huán)。-1 ℃貯藏時(shí)進(jìn)入PPP的通量要高于4 ℃，說(shuō)明4 ℃條件下機(jī)體的分解代謝速率比-1 ℃貯藏條件下要快，-1 ℃條件下合成代謝增強(qiáng)。這與Marsh等[31]報(bào)道的提高肌肉溫度可以加快代謝速率結(jié)論一致。這表明溫度對(duì)代謝通量具有明顯的調(diào)節(jié)作用，溫度越低分解代謝速率越低，這對(duì)于實(shí)際的理論研究具有一定的指導(dǎo)意義。

為了進(jìn)一步分析不同溫度不同貯藏時(shí)間下，宰后豬里脊肉乳酸代謝通量的變化趨勢(shì)及乳酸代謝通量的分布規(guī)律，建立如圖6所示的柱狀圖。

圖 6 不同貯藏溫度對(duì)豬里脊肉乳酸代謝通量的影響Fig. 6 Effect of different storage temperatures on lactic acid metabolic flux in pork tenderloin

由圖6可知，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，在4 ℃和-1 ℃貯藏下的乳酸代謝通量均顯示先上升后緩慢下降的趨勢(shì)，且宰后豬里脊肉的乳酸代謝通量在4 ℃貯藏12 h時(shí)已經(jīng)達(dá)到最大值，而在-1 ℃貯藏下的乳酸代謝通量24 h才達(dá)到最大值，比4 ℃貯藏延遲12 h 。4 ℃貯藏0.5～12 h的豬里脊肉乳酸代謝通量之間差異顯著，這一結(jié)果與朱學(xué)伸[3]的報(bào)道結(jié)果類似。-1 ℃貯藏下豬里脊肉的乳酸代謝通量在0.5～12 h之間出現(xiàn)顯著上升的趨勢(shì)（P＜0.05），24 h后開(kāi)始降低，72～168 h之間差異不顯著（P＞0.05）。在貯藏0.5～12 h時(shí)4 ℃和-1 ℃的乳酸代謝通量具有顯著差異（P＜0.05）。結(jié)果表明：-1 ℃貯藏比4 ℃能夠更有效地減緩EMP的速率，同時(shí)對(duì)乳酸含量的降低也有一定的延緩作用。溫度可以影響EMP的速率，低溫可以抑制或者減緩乳酸的積累，這與王會(huì)松等[32]研究發(fā)現(xiàn)某些原因（如常規(guī)的低溫貯藏或適當(dāng)溫度的熱處理等）可以使甜瓜呼吸代謝受到限制從而產(chǎn)生較多的乳酸，此時(shí)機(jī)體的分解代謝降低，更有利于延長(zhǎng)果蔬的貨架期有相似之處。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)宰后豬里脊肉在不同溫度和不同貯藏時(shí)間下的乳酸代謝通量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)宰后豬里脊肉在冰溫-1 ℃貯藏下葡萄糖、乳酸、NADH的含量均與4 ℃貯藏條件下的明顯差異，且-1 ℃貯藏下的保鮮效果好于4 ℃，從代謝網(wǎng)絡(luò)圖中發(fā)現(xiàn)，在不同溫度相同貯藏時(shí)間下的乳酸代謝通量明顯不同，并且在同一溫度下不同貯藏時(shí)間的乳酸代謝通量也顯著不同，且在貯藏0.5～12 h期間，-1 ℃貯藏的豬里脊肉乳酸代謝通量比4 ℃貯藏時(shí)低，而在貯藏12～168 h期間，-1 ℃的乳酸代謝通量高于4 ℃，表明低溫有利于降低葡萄糖的分解代謝，延緩了葡萄糖在EMP途徑中轉(zhuǎn)化為乳酸的速率，從而延緩了乳酸的積累。通過(guò)對(duì)乳酸代謝通量的分析，期望從基本的代謝水平來(lái)揭示宰后鮮肉受到外部環(huán)境影響后機(jī)體的變化，以便為尋找適合鮮肉貯藏的最佳溫度條件提供更為科學(xué)的理論和依據(jù)。