中國(guó)兒童谷氨酸脫氫酶型先天性高胰島素血癥臨床及遺傳學(xué)特征分析

呂葛 徐子迪 惠培培 曾俏 劉敏 閆潔 吳玉筠 桑艷梅

1國(guó)家兒童醫(yī)學(xué)中心，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院檢驗(yàn)中心，北京 100045；2國(guó)家兒童醫(yī)學(xué)中心，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院內(nèi)分泌遺傳代謝中心，北京 100045

先天性高胰島素血癥(congenital hyperinsulinism, CHI)是一種遺傳異質(zhì)性疾病，由于胰島素自律性分泌過(guò)多，血胰島素濃度增加，從而導(dǎo)致出生后出現(xiàn)頑固性、持久性低血糖的表現(xiàn)，是嬰幼兒和兒童時(shí)期持續(xù)性、復(fù)發(fā)性低血糖的重要原因。迄今已發(fā)現(xiàn)至少14種基因突變與CHI的遺傳發(fā)病機(jī)制有關(guān)，表現(xiàn)為13種遺傳學(xué)類型，不同類型CHI患兒的臨床特征、治療方案、治療效果及預(yù)后不盡相同[1-4]。谷氨酸脫氫酶型先天性高胰島素血癥(glutamate dehydrogenase hyperinsulinism, GDH-HI)是CHI的第2種常見(jiàn)類型，由編碼線粒體酶谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase，GDH)的GLUD1基因功能增強(qiáng)性突變引起。本研究分析10例GDH-HI患兒的臨床及遺傳學(xué)特征，以期提高臨床醫(yī)師對(duì)該病的認(rèn)識(shí)。

資料和方法

一、研究對(duì)象

選取2008年2月至2018年12月間北京兒童醫(yī)院收治的10例臨床初步診斷為GDH-HI患兒家系為研究對(duì)象。CHI診斷指標(biāo)包括高胰島素血癥(胰島素>2 mU/L)、低脂肪酸血癥(游離脂肪酸<1.5 mmol/L)、低酮血癥(β-羥丁酸<2.0 mmol/L)、1 mg靜脈胰高血糖素試驗(yàn)反應(yīng)血糖變化>0.3 g/L[5]。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患兒父母均簽署知情同意書(shū)。

二、遺傳學(xué)分析

留取患兒及父母的血液標(biāo)本3 ml，采用BloodGen Midi Kit(CWBIO，中國(guó))提取患者全基因組DNA，然后分別應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)DNA(PCR-DNA)直接測(cè)序技術(shù)(病例1、3、4和5)和二代測(cè)序技術(shù)(其余6例病例)進(jìn)行相關(guān)致病基因分析。

PCR-DNA直接測(cè)序：利用Premier5.0軟件設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增GLUD1基因第6、7、10、11、12外顯子區(qū)域的引物(表1)。PCR反應(yīng)體積為50 μL，含5×GoTaq緩沖液10 μL、2.0 mmol/L Mg2+、0.2 mmol/L dNTP、正反向引物各1 μmol/L，1.25 U熱啟動(dòng)Taq酶(美國(guó)Promega公司)。在Labnet熱循環(huán)儀(美國(guó)Labnet公司)擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s、58～62℃ 30 s，72℃ 45 s，循環(huán)38次，最后72℃ 5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離、回收片段，采用天根公司膠回收試劑盒純化產(chǎn)物，由北京英俊公司行直接測(cè)序。

表1 GLUD1基因擴(kuò)增引物序列

二代測(cè)序：參考OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)信息[1-4]，將與低血糖相關(guān)的基因組外顯子區(qū)通過(guò)捕獲探針(SeqCap EZ MedExome Enrichment Kit 探針，瑞士羅氏公司)進(jìn)行目標(biāo)基因全外顯子捕獲，經(jīng)Illumina hiseq XTen平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)化上機(jī)測(cè)序。若經(jīng)二代測(cè)序發(fā)現(xiàn)患兒攜帶GLUD1基因突變，則根據(jù)基因所驗(yàn)證位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)引物，采用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列及擴(kuò)增條件同上，擴(kuò)增產(chǎn)物純化后上ABI 3730XL測(cè)序儀測(cè)序，采用DNASTAR軟件進(jìn)行基因序列分析和比對(duì)。

結(jié) 果

一、臨床特征

10例患兒中男性8例，女性2例，出生體重為2.65～4.25 kg；9例為足月適齡兒，1例為巨大兒；發(fā)病年齡為出生后1 d～14個(gè)月，中位年齡為8個(gè)月。8例患兒首發(fā)癥狀為抽搐，2例首發(fā)癥狀為反應(yīng)弱?；純壕鶡o(wú)低血糖家族史。10例患兒血糖為1.40～2.60 mmol/L，均低于正常值；血胰島素為3.54～45.02 mU/L，均高于正常值；9例伴有無(wú)癥狀性高氨血癥(血氨正常值為18～72 μmol/L)，1例患兒(病例7)血氨正常，為巨大兒。10例患兒確診為CHI后，其中9例予以二氮嗪試驗(yàn)性治療。二氮嗪起始劑量為5 mg·kg-1·d-1，每日2～3次口服，并根據(jù)患兒病情逐漸增加劑量，最大劑量為15 mg·kg-1·d-1。同時(shí)加用氫氯噻嗪利尿(1～2 mg·kg-1·d-1，分2～3次口服)，防止水鈉潴留，并加用10%氯化鉀1～2 ml· kg-1·d-1，分3次口服，防止利尿劑引起的低鉀血癥。9例患兒均對(duì)二氮嗪治療有效。另1例未進(jìn)行治療(表2)。

二、遺傳學(xué)特征

10例患兒均發(fā)現(xiàn)攜帶GLUD1基因(NM_005271.5)突變，均為錯(cuò)義突變。病例1攜帶c.1388A>T突變，致p.N463I(外顯子10)，為新生突變；病例2攜帶c.1495C>A突變，致p.G499C(外顯子12)，為新生突變；病例3、4、7、9、10均攜帶c.965C>T突變，致p.R322H(外顯子7)，其中病例3為父系常染色體顯性遺傳，其余均為新生突變；病例5攜帶c.1493C>T突變，致p. S498L(外顯子11)，為新生突變；病例6攜帶c.1519G>A突變，致p.H507Y(外顯子12)，為新生突變；病例8攜帶c.1388A>G突變，致p.N463S(外顯子10)，為新生突變(表2)。

三、隨訪結(jié)果

經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期隨訪，1例患兒確診CHI后未曾試用二氮嗪治療，通過(guò)口服葡萄糖維持正常血糖水平，在11歲左右病情自行緩解。曾用二氮嗪治療的9例患兒中7例繼續(xù)口服二氮嗪治療，可維持正常血糖，其中2例同時(shí)患有癲癇；2例患兒失訪(表2)。

表2 10例谷氨酸脫氫酶型先天性高胰島素血癥患兒臨床資料和預(yù)后情況

討 論

GDH-HI是CHI的第2種常見(jiàn)類型，約占CHI的5%。1956年Cochrane等[6]首次報(bào)道了高蛋白飲食(尤其是亮氨酸)可導(dǎo)致低血糖，當(dāng)時(shí)命名為“亮氨酸敏感性低血糖”。1998年Stanley等[7]首次描述了GDH-HI，也稱為高胰島素血癥-高氨血癥綜合征(hyperinsulinism-hyperammonemia syndrome，HI-HA)，是由線粒體基質(zhì)酶中GDH的功能增強(qiáng)性突變引起的疾病。GDH由GLUD1基因編碼， 是一種別構(gòu)蛋白，為六聚體結(jié)構(gòu)。成熟的GDH由兩套三聚體組成，在每個(gè)三聚體中，酶的亞單位通過(guò)突出的觸角樣結(jié)構(gòu)域結(jié)合在一起，使酶的各亞單位之間相互協(xié)調(diào)一致。GLUD1基因位于染色體10q23.3，含有13個(gè)外顯子，編碼505個(gè)氨基酸。

GDH-HI發(fā)病年齡跨度較大，患兒絕大多數(shù)在出生后4個(gè)月或以后，新生兒期發(fā)病者少見(jiàn)，也有部分為成年后才確診。出生體重多正常。臨床表現(xiàn)多為低血糖癥狀，如無(wú)明顯誘因的抽搐、口唇青紫、口周發(fā)青、肌張力減弱、反應(yīng)減弱、嗜睡等。患兒的低血糖癥狀可由空腹和高蛋白(尤其是亮氨酸)飲食誘發(fā)。本研究10例患兒的發(fā)病年齡為出生后1 d至14個(gè)月，9例患兒出生體重正常，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[8-9]。

隨著研究的不斷深入，迄今已發(fā)現(xiàn)了37種GLUD1基因雜合突變，目前僅報(bào)道過(guò)1例GDH-HI患兒同時(shí)攜帶母系遺傳的移碼突變(c.37delC)和新生突變c.1493C>T(p. S498L)，其余突變類型集中在第6、7、10、11、12外顯子區(qū)的錯(cuò)義突變[10]。突變位于外顯子11、12者約占48%，位于外顯子6、7者約占29%。本研究10例患兒共發(fā)現(xiàn)了6種GLUD1基因突變類型，其中攜帶GDH外顯子7 p.R322H突變者占50%(5/10)，攜帶外顯子11、12突變者占30%(3/10)，攜帶外顯子10突變者占20%(2/10)，提示GDH p.R322H可能是中國(guó)GDH-HI患兒的熱點(diǎn)突變類型。本組患兒的突變分布比例與國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道有所不同，考慮與樣本量較小或人種差異有關(guān)。 GDH-HI的遺傳方式為常染色體顯性遺傳或新生突變，其中常染色體顯性遺傳約占20%，新生突變約占80%[11]。 本研究10例患兒中9例為新生突變，1例為父系遺傳的常染色體顯性遺傳，遺傳方式與既往報(bào)道一致[2]。

GDH-HI除可引起患兒頻發(fā)的低血糖，一般還伴有無(wú)癥狀性、持續(xù)性高氨血癥(可達(dá)正常值上限的3～5倍)?；純旱母哐敝挡粫?huì)因低血糖發(fā)作、高蛋白飲食而升高，也不會(huì)因限制蛋白飲食或二氮嗪治療而降低，但并非所有的GDH-HI患者均存在高氨血癥[12]。產(chǎn)生高氨血癥的機(jī)制主要包括：(1)GDH活性增強(qiáng)，導(dǎo)致谷氨酸產(chǎn)生的氨增加。(2)谷氨酸的消耗增多，減少N-乙酰谷氨酸的產(chǎn)生，而后者是氨解毒第一步所必需的變構(gòu)活化劑。注射N-乙酰谷氨酸的類似物N-氨基甲酰谷氨酸可降低血氨，以此可證明該機(jī)制的存在[13]。本研究10例中9例表現(xiàn)出高氨血癥，1例血氨值正常。2001年Santer等[14]曾報(bào)道2例攜帶GDH p.R322H突變的患兒，其血氨值均正常，此現(xiàn)象的發(fā)生可能是由于患兒為GLUD1基因突變的嵌合體(突變細(xì)胞與正常細(xì)胞并存)，在肝臟組織中該基因突變?nèi)笔Щ蛲蛔兟?50%。相關(guān)研究結(jié)果提示高氨血癥并不具有基因特異性，但是需要進(jìn)一步進(jìn)行肝臟或胰腺活檢來(lái)證明這種可能性[13]。

文獻(xiàn)報(bào)道，46%～64%的GDH-HI患兒可伴有癲癇，他們的基因突變多發(fā)生在外顯子6和7[13]，攜帶GDH外顯子10、11、12的患兒也可發(fā)生癲癇，癲癇最早可在新生兒時(shí)期出現(xiàn)[15]。本研究中2例患兒患有癲癇，病例2于低血糖發(fā)病1個(gè)月后(2月齡)確診癲癇，病例9于低血糖發(fā)病3個(gè)月后(9月齡)確診癲癇，突變類型分別為GDH p.R322H和p.G499C，分別位于GDH的第7和12外顯子，這種不同突變位置與基因型-表現(xiàn)型的相關(guān)機(jī)制尚不明確。

因患兒胰腺β細(xì)胞的ATP敏感性鉀通道是正常的，故絕大多數(shù)GDH-HI患兒對(duì)二氮嗪治療有效[16-18]，目前尚未發(fā)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道二氮嗪治療無(wú)效的GDH-HI。本研究 10例中9例試用二氮嗪治療，均有效，與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。GDH-HI患兒建議給予低蛋白飲食作為輔助治療，每餐亮氨酸≤200 mg可有助于降低二氮嗪的用量[19]。

本研究8例經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期隨訪，其中7例患兒均繼續(xù)服用二氮嗪進(jìn)行治療，可維持空腹血糖正常。長(zhǎng)期應(yīng)用二氮嗪過(guò)程中，除部分患兒有多毛表現(xiàn)外，未見(jiàn)其他藥物不良反應(yīng)。研究資料顯示，隨著CHI患兒的年齡增長(zhǎng)及其對(duì)胰島素需要量的增加，其低血糖癥狀可有所減輕，部分患兒可自愈。有研究對(duì)101例CHI患兒隨訪發(fā)現(xiàn)，約48%的CHI患兒低血糖可自行緩解，且自行緩解的時(shí)間跨度較長(zhǎng)(3個(gè)月至8歲左右)；在未檢測(cè)出已知致病基因突變的患兒中，約65%患兒可自行緩解。而自行緩解的患兒中約15%是ATP敏感性鉀離子通道型先天性高胰島素血癥(由ABCC8或KCNJ11基因突變導(dǎo)致)，另有4%的患兒攜帶GLUD1、GCK或HNF4α基因突變[20]。本組1例患兒未試用二氮嗪，間斷口服葡萄糖溶液來(lái)維持血糖正常，于11歲時(shí)低血糖癥狀自行緩解，提示攜帶GDH-HI突變的患兒存在自行緩解的可能性。

總之，中國(guó)兒童GDH-HI的臨床特征和遺傳學(xué)特征與其他人種相比差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但GDH p.R322H突變?yōu)橹袊?guó)兒童GDH-HI的熱點(diǎn)突變類型。GDH-HI患兒多對(duì)二氮嗪治療有效，部分患兒可出現(xiàn)癲癇。隨著病程的進(jìn)展，少數(shù)患兒存在自行緩解的可能。值得一提的是，少數(shù)患兒血氨可正常，臨床須注意避免漏診。細(xì)致的致病基因分析對(duì)患兒的遺傳學(xué)分型、診療方案的確立、隨訪、預(yù)后的判斷和遺傳咨詢等均有重要意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突