崔宏，黨進進，張加玲

(山西醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院，太原 030001)

大蒜作為一種調(diào)味品，被人們廣泛使用，其不僅含有多種營養(yǎng)成分，還具有較強的防癌和抗癌作用，這與大蒜中的硒(Se)含量較高有關[1-3]。硒是人體必需的微量元素，有研究表明[4,5]硒缺乏與克山病、大骨節(jié)病等有關；當硒過量時，可能會發(fā)生硒中毒，并且可能出現(xiàn)頭暈、頭痛、虛弱、惡心、嘔吐、腹瀉和大蒜汗臭味等癥狀[6]，因此，測定大蒜中的硒含量很有意義。

硒的測定方法有很多，如紫外可見分光光度法、原子熒光光譜法、原子吸收光譜法、原子發(fā)射光譜法等[7-11]。氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法測定硒具有靈敏度高、精密度好、線性范圍寬等優(yōu)點[12,13]，因此，本實驗旨在通過氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法測定大蒜中硒的含量，并使用正交設計優(yōu)化儀器條件，為研究大蒜中的硒營養(yǎng)作用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

硼氫化鉀(KBH4)：天津市恒興試劑有限公司；氫氧化鈉(NaOH)：成都市科龍化工試劑廠；二氧化硒：國藥集團化學試劑有限公司；硒酸鈉、亞硒酸鈉：均為分析純，山東西亞化學工業(yè)有限公司；硝酸：天津市天力化學試劑有限公司；高氯酸： 天津政成化學制品有限公司；鹽酸：為優(yōu)級純；實驗用水：為超純水(18.25 MΩ·cm)。

1.2 儀器與設備

AFS-9700全自動注射式氫化物發(fā)生-原子熒光光度計 北京海光儀器有限公司；硒空心陰極燈 北京有色金屬研究總院；ME104E/02電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DigiBlock EHD36消解儀 北京萊伯泰科儀器股份有限公司；Smart-P系列超純水系統(tǒng) 上?？道追治鰞x器有限公司。所有玻璃器皿在20%(20∶80)硝酸中浸泡超過24 h，用超純水沖洗干凈備用。

1.3 實驗方法

1.3.1 硒標準溶液的配制

準確稱取0.3513 g SeO2(相當于0.2500 g Se)溶解于250 mL容量瓶中，用5%鹽酸溶液(5∶95)定容，得到Se標準儲備液，濃度為1 mg/mL；繼續(xù)采用5%鹽酸溶液稀釋，得到Se標準中間液；采用25%鹽酸稀釋得標準應用液，濃度分別為1，2，4，5，8，10，15，20 μg/L。

1.3.2 硒酸鈉(Se6+)、亞硒酸鈉(Se4+)溶液的配制

分別稱取0.2189 g亞硒酸鈉、02407 g硒酸鈉，溶解于100 mL容量瓶中，含硒(以Se6+、Se4+計)濃度1 g/L，分別稀釋得100 μg/L硒酸鈉(Se6+)和亞硒酸鈉(Se4+)使用液。

1.3.3 樣品處理

采用濕法消化處理樣品，將大蒜去皮并切碎，稱取2.000 g于消解管中，加入10 mL混酸(硝酸∶高氯酸為9∶1)，浸泡過夜，置于電熱消解儀裝置上，根據(jù)設定的溫度和時間(見表1)消化，同時，做混酸消解空白。當溶液變成澄清無色并伴有白煙時，繼續(xù)加熱至體積1～2 mL左右，加入2 mL水，再繼續(xù)加熱至1～2 mL，冷卻至室溫。再加入5 mL 6 mol/L 鹽酸，將混合溶液在沸水浴中加熱20 min進行還原，然后用水定容至10 mL比色管中測定，同時配制樣品空白。

表1 消解儀溫度程序Table 1 Digester temperature program

2 結果與分析

2.1 儀器條件的選擇

使用正交試驗設計選擇儀器條件，分別定義A: 負高壓(260，270，280 V)、B: 燈電流(60，70，80 mA)、C: 載氣流量(300，400，500 mL/min)、D:屏蔽氣流量(800，900，100 mL/min)，建立4 因素3水平的L9(34) 正交試驗設計表。使用10 μg/L Se標準溶液，根據(jù)試驗設計進行 9 組試驗，結果見表2。

表2 L9 (34)正交表試驗方案、測定結果和基本計算Table 2 Scheme, determination results and basic calculation of L9 (34) orthogonal test

注：k1、k2、k3為同一水平相對熒光強度值總和/實驗次數(shù)(3次)；R 表示極差，為每列k1、k2、k3數(shù)據(jù)中最大值與最小值之差。

由表2可知，第9組為較優(yōu)條件。通過R值可得出影響 Se熒光強度測定結果的因素由大到小排列順序為：負高壓>燈電流>載氣流量>屏蔽氣流量。

根據(jù)表2的試驗結果，繪制出熒光強度隨負高壓(A)、燈電流(B)、載氣流量(C)、屏蔽氣流量(D)變化的趨勢圖，見圖1。

圖1 儀器條件對硒熒光強度的影響Fig.1 Effect of instrument conditions on fluorescence intensity of selenium

注：A為負高壓；B為燈電流；C為載氣流量；D為屏蔽氣流量。

由圖1可知，負高壓(280 V)、燈電流(80 mA)、載氣流量(300 mL/min)、屏蔽氣流量(800 mL/min)，即A3B3C1D1為測定Se的較優(yōu)條件。

在正交試驗表2中9組試驗中未列出A3B3C1D1實驗條件，因此，比較和測定A3B3C1D1組與表2中第9組。最終選出儀器最優(yōu)條件：負高壓(280 V)、燈電流(80 mA)、載氣流量(300 mL/min)、屏蔽氣流量(800 mL/min)，同時考慮到燈電流過大會縮短燈的壽命，故將燈電流調(diào)整為70 mA。儀器工作參數(shù)結果見表3。

表3 儀器工作參數(shù)Table 3 Instrument operating parameters

2.2 試劑條件的選擇

2.2.1 介質(zhì)鹽酸濃度的選擇

用10 μg/L Se標準溶液測定，分別考察了2.5%～20%鹽酸稀釋Se標準溶液對熒光強度的影響，結果見圖2。

圖2 介質(zhì)鹽酸濃度對熒光強度的影響Fig.2 Effect of hydrochloric acid concentration in medium on fluorescence intensity

由圖2可知，當鹽酸濃度大于5%時，熒光強度大且基本保持穩(wěn)定，但因在樣品進行消解后還原過程中，加入5 mL 6 mol/L的鹽酸，定容至10 mL，其酸性介質(zhì)濃度相當于25%鹽酸，因此實驗選用25%鹽酸作為酸性介質(zhì)。

2.2.2 載流鹽酸濃度的選擇

用10 μg/L Se標準溶液進行測定，分別考察了2.5%～12.5%鹽酸作為載流對熒光強度的影響，結果見圖3。

圖3 載流鹽酸濃度對熒光強度的影響Fig.3 Effect of current-carrying hydrochloric acid concentration on fluorescence intensity

由圖3可知，當鹽酸濃度大于5%時，熒光強度大且穩(wěn)定，故選擇5%鹽酸作為載流。

2.2.3 硼氫化鉀濃度的選擇

采用20 μg/L Se標準溶液進行測定，分別考察了5.5～16.5 g/L KBH4作為還原劑對熒光強度的影響，結果見圖4。

圖4 硼氫化鉀濃度對熒光強度的影響Fig.4 Effect of potassium borohydride concentration on fluorescence intensity

由圖4可知，當KBH4濃度大于10 g/L時，信號強度有所下降，這可能是由于高濃度KBH4產(chǎn)生大量的氫氣，稀釋了待測元素氫化物，故實驗選用10 g/L KBH4溶液。

2.2.4 氫氧化鈉濃度對熒光強度的影響

為了保證還原劑KBH4的穩(wěn)定性，需在配制KBH4溶液時加入NaOH，但NaOH的濃度應嚴格把控，若加入過多會與鹽酸中和，從而降低反應體系的酸度以致于影響測定結果。因此，分別對NaOH濃度為2.1～6.3 g/L進行實驗，以10 μg/L Se標準溶液進行測定，考察其對熒光強度的影響，結果見圖5。

圖5 氫氧化鈉濃度對熒光強度的影響Fig.5 Effect of sodium hydroxide concentration on fluorescence intensity

由圖5可知，熒光強度先上升后下降，在5 g/L時達到最大，故實驗選用NaOH的濃度為5 g/L。

2.3 Se6+還原程度實驗

由于樣品溶液經(jīng)消解處理后，其中可能含有的Se6+很難被KBH4還原，故需在測定前將Se6+還原為Se4+。分別取2 mL 100 μg/L硒酸鈉(Se6+)和亞硒酸鈉(Se4+)使用液，分別加入5 mL 6 mol/L鹽酸，進行沸水浴加熱還原，定容至10 mL測定。研究了加熱時間對Se6+還原效果的影響，結果見圖6。

圖6 還原反應時間對熒光強度的影響Fig.6 Effect of reduction reaction time on fluorescence intensity

實驗結果表明，在沸水浴中用5 mL 6 mol/L 鹽酸溶液還原Se6+，反應大約15～30 min時，Se6+可全部定量轉化為Se4+，且Se4+在該條件下不會發(fā)生濃度變化，故實驗選擇在沸水浴中加入5 mL 6 mol/L鹽酸，并加熱20 min進行還原。將該還原條件應用到樣品大蒜消解后還原過程中。

2.4 線性關系、檢出限及精密度

Se含量在0～20 μg/L范圍內(nèi)的線性關系良好，相關系數(shù) r=0.9998，回歸方程Y=179.090X+5.668，見圖7。

圖7 標準曲線Fig.7 Standard curve

將11次空白溶液測定值標準差的3倍，除以標準曲線的斜率計算得到檢出限(DL=3S/b)，結果為0.06 μg/L。對5 μg/L Se標準溶液進行平行測定(n=6)，計算得精密度(RSD)為3.1%。

2.5 干擾實驗

在此方法的測定中，以Cu2+干擾較為嚴重，會降低熒光強度，產(chǎn)生負干擾。文獻報道[14]，大蒜中Cu2+的含量約為Se的40倍。本實驗結果也表明，40倍的Cu2+對大蒜中Se的測定干擾明顯，但當最終測定的樣品溶液經(jīng)消解、還原后，酸度(以鹽酸計)已達到25%時，可以抑制Cu2+的干擾。

2.6 準確度實驗

通過加標回收實驗測定方法的準確度，選取一種大蒜按照1.3.3中實驗方法，進行加標回收實驗(n=6)，結果見表4，回收率為91.5%～102.8%。

表4 加標回收實驗結果(n=6)Table 4 Recovery experiment results (n=6)

2.7 樣品測定

在最佳實驗條件下，分別測定3種大蒜中的Se，其含量分別為5.80，4.36，3.90 μg/100 g。

3 結論

本實驗建立的氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法測定大蒜中硒含量的方法，不僅靈敏度高，重復性好，準確度高，而且操作簡單、安全。