謝文佳，石盼盼，陳蕾 ，李軻

(1.河南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，鄭州 450047；2.鄭州海關(guān)技術(shù)中心，鄭州 450003)

芝麻醬也叫麻醬，由炒熟的芝麻磨碎制成，味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，是一種深受消費(fèi)者喜愛(ài)的香味調(diào)味品。但是，出于追求超額利潤(rùn)的需要，部分不法商人可能在芝麻醬中摻入其他油料作物成分，不僅給消費(fèi)者帶來(lái)了經(jīng)濟(jì)損失，甚至危害消費(fèi)者的身體健康[1]。目前，芝麻醬的摻假一般通過(guò)檢測(cè)芝麻醬中脂肪酸的種類(lèi)和含量、特征風(fēng)味物質(zhì)[2，3]，或者利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)目標(biāo)物特異性DNA序列進(jìn)行鑒定[4,5]。

環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop -mediated isothermal amplification，LAMP)是一種分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)目標(biāo)物特異性DNA序列的新方法。該方法利用4 條特異性引物識(shí)別靶基因上的6個(gè)特定區(qū)域和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增效率可達(dá)108～1010 kb/min，反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物是一系列反向重復(fù)的靶序列構(gòu)成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)和多環(huán)花椰菜結(jié)構(gòu)的雙鏈DNA片段混合物。

本文根據(jù)芝麻、花生、葵花籽的特異性基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，建立了芝麻醬中芝麻、花生、葵花籽源性成分的LAMP檢測(cè)方法，并應(yīng)用該方法對(duì)市售的41份純芝麻醬樣品進(jìn)行了檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：41種純芝麻醬樣品均隨機(jī)購(gòu)自超市，芝麻、花生、葵花籽、大豆、水稻、玉米、燕麥、油菜、豌豆、高粱、赤小豆、小麥、蕓豆、大麥、黑豆等購(gòu)自超市或農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

主要試劑：植物DNA提取試劑盒、大豆內(nèi)源核酸檢測(cè)試劑盒、玉米內(nèi)源核酸檢測(cè)試劑盒、水稻內(nèi)源核酸檢測(cè)試劑盒、DNA擴(kuò)增試劑盒(恒溫?cái)U(kuò)增法SR01-24，含酶)、植物內(nèi)源核酸檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自廣州迪澳生物科技有限公司；內(nèi)引物、外引物和環(huán)引物由賽默飛世爾科技上海工廠合成。

1.2 主要儀器

LightCycler 480Ⅱ型熒光定量PCR儀：美國(guó)羅氏公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA提取

DNA提取采用植物基因組DNA提取試劑盒，按照使用說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行制備和提取，提取后均采用植物內(nèi)源核酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，出現(xiàn)典型的“S”型曲線說(shuō)明提取的DNA符合要求。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)

分別選擇芝麻2S Albumin、花生Arah2.01、葵花籽HaG5基因，使用Primer ExploerV4 (http：//primer exlorer.jp)設(shè)計(jì)相應(yīng)的的特異性引物，分別包括2條外引物F3和B3、2條內(nèi)引物FIP和BIP以及2條環(huán)引物FLP和BLP(花生無(wú)環(huán)引物)。引物DNA序列見(jiàn)表1，由賽默飛世爾科技上海工廠合成。

表1 LAMP擴(kuò)增的引物Table 1 Primers for LAMP amplification

續(xù) 表

1.3.3 LAMP擴(kuò)增反應(yīng)

按照DNA擴(kuò)增試劑盒(恒溫?cái)U(kuò)增法SR01-24，含酶)說(shuō)明書(shū)內(nèi)“實(shí)時(shí)熒光法”所示步驟使用熒光定量PCR儀進(jìn)行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)體系見(jiàn)表2。

表2 LAMP擴(kuò)增的反應(yīng)體系Table 2 The reaction system of LAMP amplification

反應(yīng)條件為：63 ℃，30 s； 63 ℃，15 s；63 ℃，45 s；共60個(gè)循環(huán)。

1.3.4 引物特異性試驗(yàn)

分別提取芝麻、花生、葵花籽、大豆、水稻、玉米、燕麥、油菜、豌豆、高粱、赤小豆、小麥、蕓豆、大麥、黑豆15種農(nóng)作物樣本的DNA作為模板，用超純水代替DNA模板做陰性對(duì)照，以芝麻特異性引物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，驗(yàn)證引物對(duì)芝麻源性成分檢測(cè)的特異性。同樣地，分別采用花生、葵花籽特異性引物進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，驗(yàn)證引物對(duì)花生、葵花籽源性成分檢測(cè)的特異性。

1.3.5 靈敏度試驗(yàn)

以花生、葵花籽、大豆(質(zhì)量比1∶1∶1)的充分混合物為基體，制成含芝麻質(zhì)量百分比分別為5%、1%、0.5%、0.1%的混合物提取DNA，用超純水代替DNA模板做陰性對(duì)照，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，確定芝麻源性成分的檢測(cè)靈敏度。

以芝麻、葵花籽、大豆(質(zhì)量比1∶1∶1)的充分混合物為基體，制成含花生質(zhì)量百分比分別為5%、1%、0.5%、0.1%的混合物提取DNA，用超純水代替DNA模板做陰性對(duì)照，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，確定花生源性成分的檢測(cè)靈敏度。

以芝麻、花生、大豆(質(zhì)量比1∶1∶1)的充分混合物為基體，制成含葵花籽質(zhì)量百分比分別為5%、1%、0.5%、0.1%的混合物提取DNA，用超純水代替DNA模板做陰性對(duì)照，進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，確定葵花籽源性成分的檢測(cè)靈敏度。

1.3.6 對(duì)市售41個(gè)芝麻醬樣品6種植物源性成分的檢測(cè)

從超市隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)41瓶芝麻醬，應(yīng)用上述方法分別對(duì)這些樣本中的芝麻、花生、葵花籽源性成分進(jìn)行檢測(cè)，并分別使用大豆內(nèi)源核酸檢測(cè)試劑盒、玉米內(nèi)源核酸檢測(cè)試劑盒、水稻內(nèi)源核酸檢測(cè)試劑盒對(duì)大豆、玉米、水稻源性成分進(jìn)行檢測(cè)，以調(diào)查市場(chǎng)上芝麻醬的真?zhèn)吻闆r。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 芝麻源性成分的檢測(cè)

2.1.1 引物的特異性檢測(cè)

根據(jù)芝麻2S Albumin基因所設(shè)計(jì)的內(nèi)、外引物及環(huán)引物對(duì)芝麻DNA有顯著擴(kuò)增，而對(duì)其他14種植物樣本DNA均無(wú)擴(kuò)增，說(shuō)明該引物對(duì)芝麻源性成分檢測(cè)具有良好的特異性，見(jiàn)圖1。

圖1 芝麻源性成分LAMP特異性擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 LAMP specific amplification results of sesame-derived components

注：0為陽(yáng)性對(duì)照；1為芝麻；2～15為花生、葵花籽、大豆、水稻、玉米、燕麥、油菜、豌豆、高粱、赤小豆、小麥、蕓豆、大麥、黑豆；16為陰性對(duì)照。

2.1.2 芝麻源性靈敏度測(cè)定

從含芝麻質(zhì)量百分比分別為5%、1%、0.5%、0.1%的混合物中提取DNA為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，都產(chǎn)生了明顯的熒光反應(yīng)曲線，與之相對(duì)的陰性對(duì)照未檢測(cè)到擴(kuò)增反應(yīng)(見(jiàn)圖2)，因此該LAMP反應(yīng)能夠檢測(cè)低至0.1%的混合物中芝麻源性成分的存在。

圖2 芝麻源性成分LAMP擴(kuò)增靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Detection results of LAMP amplification sensitivity of sesame-derived components

注：0為陽(yáng)性對(duì)照；1～4為5%、1%、0.5%、0.1%；5為陰性對(duì)照。

2.2 花生成分的檢測(cè)

2.2.1 引物的特異性檢測(cè)

根據(jù)花生Arah2.01基因所設(shè)計(jì)的內(nèi)、外引物對(duì)花生DNA有顯著擴(kuò)增，而對(duì)其他14種植物樣本DNA均無(wú)擴(kuò)增，說(shuō)明該引物對(duì)花生源性成分檢測(cè)具有良好的特異性，見(jiàn)圖3。

圖3 花生源性成分LAMP特異性擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 LAMP specific amplification results of peanut-derived components

注：0為陽(yáng)性對(duì)照；1為花生；2～15為芝麻、葵花籽、大豆、水稻、玉米、燕麥、油菜、豌豆、高粱、赤小豆、小麥、蕓豆、大麥、黑豆；16為陰性對(duì)照。

2.2.2 花生源性靈敏度測(cè)定

從含花生質(zhì)量百分比分別為5%、1%、0.5%、0.1%的混合物中提取DNA為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，都產(chǎn)生了明顯的熒光反應(yīng)曲線，與之相對(duì)的陰性對(duì)照未檢測(cè)到擴(kuò)增反應(yīng)(見(jiàn)圖4)，因此該LAMP反應(yīng)能夠檢測(cè)低至0.1%的混合物中花生源性成分的存在。

圖4 花生源性成分LAMP靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.4 LAMP sensitivity test results of peanut- derived components

注：0為陽(yáng)性對(duì)照；1～4為5%、1%、0.5%、0.1%；5為陰性對(duì)照。

2.3 葵花籽成分的檢測(cè)

2.3.1 引物的特異性檢測(cè)

根據(jù)葵花籽HaG5基因所設(shè)計(jì)的內(nèi)、外引物及環(huán)引物對(duì)葵花籽DNA有顯著擴(kuò)增，而對(duì)其他14種植物樣本DNA均無(wú)擴(kuò)增，說(shuō)明該引物對(duì)葵花籽源性成分檢測(cè)具有良好的特異性，見(jiàn)圖5。

圖5 葵花籽源性成分LAMP特異性擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 LAMP specific amplification results of sunflower seed-derived components

注： 0為陽(yáng)性對(duì)照；1為葵花籽；2～15為花生、芝麻、大豆、水稻、玉米、燕麥、油菜、豌豆、高粱、赤小豆、小麥、蕓豆、大麥、黑豆；16為陰性對(duì)照。

2.3.2 葵花籽源性靈敏度測(cè)定

圖6 葵花籽源性成分LAMP靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.6 LAMP sensitivity test results of sunflower seed-derived components

注：0為陽(yáng)性對(duì)照；1～4為5%、1%、0.5%、0.1%；5為陰性對(duì)照。

從含葵花籽質(zhì)量百分比分別為5%、1%、0.5%、0.1%的混合物中提取DNA為模板進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，都產(chǎn)生了明顯的熒光反應(yīng)曲線，與之相對(duì)的陰性對(duì)照中未檢測(cè)到擴(kuò)增反應(yīng)(見(jiàn)圖6)，因此該LAMP反應(yīng)能夠檢測(cè)低至0.1%的混合物中葵花籽源性成分的存在。

2.4 市售41個(gè)芝麻醬樣品6種植物源性成分的檢測(cè)結(jié)果

市售41份芝麻醬樣本中全部檢出芝麻源性成分；檢出花生源性18例，占比為43.90%；檢出葵花籽源性成分1例，占比為2.43%；檢出大豆源性成分2例，占比為4.89%；水稻源性和玉米源性成分均未檢出。

3 討論

環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù) (loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是2000年由日本研究人員Notomi等發(fā)明的一種較為新型的體外DNA擴(kuò)增技術(shù)，該方法克服了熒光定量PCR技術(shù)需要通過(guò)反復(fù)的熱變性過(guò)程獲得單鏈模板的缺點(diǎn)，大大節(jié)省了反復(fù)升降溫的時(shí)間，可實(shí)現(xiàn)在恒溫條件下進(jìn)行連續(xù)的快速擴(kuò)增，不需要復(fù)雜、昂貴的溫控和輔助設(shè)備；同時(shí)，該方法不需合成價(jià)格昂貴的探針，但仍然具有高度的反應(yīng)特異性。因此，LAMP技術(shù)是一種更為準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，能夠適應(yīng)大批量樣本的現(xiàn)場(chǎng)快速鑒定的技術(shù)，已在臨床病原微生物檢測(cè)、遺傳病診斷、SNP分型、傳染病監(jiān)測(cè)和轉(zhuǎn)基因食品鑒定等領(lǐng)域顯示出了巨大的應(yīng)用潛力并正得到日益廣泛的應(yīng)用。

本文建立了一套利用LAMP技術(shù)進(jìn)行芝麻醬中芝麻、花生、葵花籽源性成分的檢測(cè)方法，能夠在60 min內(nèi)檢測(cè)低至0.1%的混合物中芝麻、花生、葵花籽源性成分的存在，具有良好的特異性，對(duì)芝麻醬摻假的鑒別有重要的實(shí)用價(jià)值。從本次市場(chǎng)抽取41個(gè)純芝麻醬的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，市售芝麻醬產(chǎn)品摻入花生、葵花籽、大豆等成分冒充純芝麻醬的現(xiàn)象比較普遍。