楊文平，馮芳，郝教敏，夏清，靳明凱，楊珍平*，高志強(qiáng)

(1.華北理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 唐山 063210；2.天津科技大學(xué)， 天津 300222；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030801；4.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801)

麥綠素(Barley Green)是從麥類植物嫩苗中獲得的一種富含蛋白質(zhì)、維生素、黃酮、超氧化物歧化酶(SOD)等200多種營養(yǎng)物質(zhì)和抗氧化活性組分的最適合人體細(xì)胞需要的復(fù)合物質(zhì)[1]，在世界單項(xiàng)資源中目前是養(yǎng)分含量最豐富和均衡的，具有降血糖、降血脂、抗癌、消炎、延緩衰老和抗疲勞等作用[2，3]。在日本，被認(rèn)定為保健食品；在美國，被批準(zhǔn)為食品增補(bǔ)劑。由此，國內(nèi)外對(duì)麥綠素的研發(fā)進(jìn)程明顯加快，國外研制開發(fā)出麥綠素可樂、麥苗膳食纖維食品、青麥酶營養(yǎng)品和麥苗SOD飲料等產(chǎn)品；國內(nèi)麥葉食品開發(fā)較晚，市場(chǎng)上也出現(xiàn)了一些麥葉相關(guān)產(chǎn)品，如麥綠素粉、麥苗粉等，還有麥綠素韌性餅干的研制等。我國幅員遼闊，麥類種質(zhì)資源豐富；麥綠素加工過程工藝參數(shù)因原料的不同而有變化，現(xiàn)階段的開發(fā)研究主要集中在大麥、青稞、蕎麥上[4-6]，而對(duì)于小麥的相關(guān)研究報(bào)道甚少。彩粒小麥作為珍貴的小麥種質(zhì)資源，因其具有獨(dú)特的營養(yǎng)成分和保健功能，備受人們關(guān)注[7]。麥綠素中，蛋白質(zhì)所含氨基酸豐富且易被人體吸收，特別是富含精氨酸、酪氨酸和組氨酸等人體必需的氨基酸，是一種很好的氮源；黃酮和SOD含量高，具有很強(qiáng)的自由基清除能力和抗氧化性能，也是目前最引人關(guān)注和研究最多的生物活性物質(zhì)[8-12]。因此，本研究選擇麥綠素中類黃酮、蛋白質(zhì)含量和SOD酶活性3種有效成分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用水提法對(duì)不同品種彩粒小麥苗，包括山農(nóng)紫小麥、紫小麥204W17、黑小麥031244和黑小麥202W20的麥綠素提取工藝進(jìn)行正交優(yōu)化和比較，為拓寬麥綠素加工原料和深入研究加工工藝提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

4個(gè)品種彩粒小麥(TriticumaestivumLinn.)，包括山農(nóng)紫小麥、黑小麥031244、紫小麥204W17、黑小麥202W20。山農(nóng)紫小麥和黑小麥031244由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥研究所提供，紫小麥204W17和黑小麥202W20由山西省農(nóng)科院棉花科學(xué)研究所提供。

1.2 儀器設(shè)備及試劑

1.2.1 儀器設(shè)備

78-1型磁力攪拌器 常州潤華電器有限公司；WFJ 2100型可見分光光度計(jì) 尤尼柯(上海)儀器有限公司；LD5-2B型低速離心機(jī) 北京雷勃爾醫(yī)療器械有限公司；電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；BCD-252KSF型冰箱 青島海爾股份有限公司。

1.2.2 試劑

3%～4% H2O2溶液，5%亞硝酸鈉溶液，10%硝酸鋁溶液，4% NaOH溶液，無水乙醇，pH 7.8磷酸緩沖液(磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉配制)，1.3×10-2mol/L Met(甲硫氨酸)溶液，7.5×10-4mol/L NBT(氯化硝基四氮唑藍(lán))，2×10-5mol/L VB2，10-4mol/L EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二鈉)溶液，牛血清蛋白，考馬斯亮藍(lán)G-250。上述試劑均為分析純配制。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

取洗凈、晾干的培養(yǎng)皿，在其內(nèi)鋪兩層濾紙并潤濕。隨機(jī)取約100粒彩粒小麥種子平鋪在濾紙上，加水至剛沒過種子。于室溫下培養(yǎng)4～5 d，移植花盆中培養(yǎng)。割取生長至15 cm左右的彩粒小麥苗，剔除雜質(zhì)和黃葉后，用3%～4% H2O2溶液浸泡20 min，之后用蒸餾水沖洗干凈，待水分晾干后備用。

1.3.2 麥綠素的提取

采用水浸提法，稱取一定量經(jīng)過預(yù)處理的小麥苗于研缽中→按一定的料液比進(jìn)行研磨→于小燒杯中在一定溫度下攪拌一定時(shí)間→于漏斗中過濾，制得濾液待用。

1.3.3 麥綠素中有效成分測(cè)定

本研究通過測(cè)定類黃酮、蛋白質(zhì)含量以及SOD酶活性來評(píng)價(jià)麥綠素的提取工藝。

類黃酮含量的測(cè)定采用硝酸鋁比色法[13]。取3 mL濾液于10 mL容量瓶中，依次加入0.5 mL亞硝酸鈉、0.5 mL硝酸鋁和4 mL氫氧化鈉，用乙醇定容，測(cè)定吸光度。類黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=19.208x-0.0049，y為吸光度，x為待測(cè)液濃度。

蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)染色法[14]。移取2 mL濾液，加蒸餾水至10 mL，取混合液1 mL與5 mL考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)，測(cè)其吸光度。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.7407x+0.025，y為吸光度，x為待測(cè)液濃度。

SOD活性的測(cè)定采用NBT光還原法[15]。取3 mL濾液，加5 mL磷酸緩沖液，離心；取上清液0.1 mL，依次加1.5 mL磷酸緩沖液，0.3 mL Met，0.3 mL NBT，0.3 mL VB2，0.3 mL EDTA，0.2 mL蒸餾水，光照后測(cè)吸光度。

計(jì)算公式：SOD總活力(U/100 g)=(Ack-Ae)×V/(Ack×0.5×W×Vt)。

式中：Ack為對(duì)照管的吸光度；Ae為樣品管的吸光度；V為樣品液總體積(mL)；Vt為測(cè)定時(shí)樣品用量(mL)；W為樣品鮮重(g)。

1.3.4 彩粒小麥苗麥綠素提取工藝的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。選取對(duì)提取麥綠素影響最大的3個(gè)單因素：浸提溫度、浸提時(shí)間和料液比，因素水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.4 數(shù)理統(tǒng)計(jì)與分析方法

對(duì)所得數(shù)據(jù)用Excel數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析軟件整理制表，并進(jìn)行LSD極差分析與LSR多重比較。用Sigma Plot 10.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種彩粒小麥苗麥綠素中類黃酮含量比較

表2 類黃酮含量的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal test results for the content of flavonoids mg/100 g

續(xù) 表

注：同列大寫字母不同，表示三水平差異極顯著(P<0.01)；同列小寫字母不同，表示三水平差異顯著(P<0.05)，表4和表6同。

由表2正交試驗(yàn)結(jié)果可知，在實(shí)測(cè)9組中，山農(nóng)紫小麥、黑小麥031244和黑小麥202W20的提取麥綠素中類黃酮的最佳工藝組合都是A1B3C3，類黃酮含量均在27 mg/100 g以上；紫小麥204W17的最佳工藝組合是A2B2C3，類黃酮含量達(dá)到40 mg/100 g以上。由LSR最小極差分析可知，浸提溫度(A)、浸提時(shí)間(B)和浸提料液比(C)3個(gè)因素對(duì)4個(gè)品種麥綠素中類黃酮含量的影響次序不同，其中對(duì)山農(nóng)紫小麥和黑小麥031244的影響次序是A>C>B，對(duì)紫小麥204W17和黑小麥202W20的影響次序是C>A>B。SSR方差分析(見表3)表明，浸提溫度對(duì)4個(gè)品種麥綠素中類黃酮含量的影響均達(dá)到顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)水平，浸提料液比對(duì)3個(gè)品種(山農(nóng)紫小麥除外)麥綠素中類黃酮含量的影響均達(dá)到顯著(P<0.05)水平，浸提時(shí)間對(duì)4個(gè)品種麥綠素中類黃酮含量的影響均不顯著(P>0.05)?；邴溇G素中類黃酮含量，4種彩粒小麥苗提取麥綠素優(yōu)選后的最優(yōu)工藝組合依次是：A1B3C3、A2B2C3、A1B3C3、A1B2C3。進(jìn)一步驗(yàn)證優(yōu)選組合與實(shí)測(cè)組合，結(jié)果表明：山農(nóng)紫小麥、黑小麥031244、黑小麥202W20提取麥綠素的最優(yōu)工藝皆為A1B3C3，類黃酮含量分別為27.81，27.92，27.18 mg/100 g；紫小麥204W17的最佳工藝是A2B2C3，類黃酮含量為40.21 mg/100 g。

比較上述兩種最優(yōu)工藝組合，后者的溫度較高，說明在一定的范圍內(nèi)，較高溫度有利于破壞植物細(xì)胞壁，縮短浸提時(shí)間，有利于類黃酮向水溶劑充分地?cái)U(kuò)散，從而提高類黃酮得率。這4種彩粒小麥苗中紫小麥204W17的類黃酮含量最高，由于類黃酮為次生代謝產(chǎn)物，是在體內(nèi)經(jīng)代謝途徑生成的，由此可推斷紫小麥204W17代謝途徑更為旺盛，若想制得富含類黃酮的麥綠素保健產(chǎn)品應(yīng)選取該品種。

注：“*”為P<0.05；“**”為P<0.01，表5和表7同。

2.2 不同品種彩粒小麥苗麥綠素中蛋白質(zhì)含量比較

表4 蛋白質(zhì)含量的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal test results of the content of protein %

續(xù) 表

由表4正交試驗(yàn)結(jié)果可知，在實(shí)測(cè)9組中，山農(nóng)紫小麥、黑小麥031244和黑小麥202W20的提取麥綠素中蛋白質(zhì)的最佳工藝組合都是A1B3C3，蛋白質(zhì)含量分別為47.70%、33.54%和38.19%；紫小麥204W17的最佳工藝組合是A2B2C3，蛋白質(zhì)含量達(dá)到49.07%。由LSR最小極差分析可知，浸提溫度(A)、浸提時(shí)間(B)和浸提料液比(C)3個(gè)因素對(duì)4個(gè)品種彩粒小麥苗麥綠素中蛋白質(zhì)含量的影響次序不同，其中對(duì)山農(nóng)紫小麥和黑小麥031244的影響次序是A>C>B，對(duì)紫小麥204W17和黑小麥202W20的影響次序是C>A>B。SSR方差分析(見表5)表明，浸提溫度對(duì)4個(gè)品種彩粒小麥苗麥綠素中蛋白質(zhì)含量的影響均達(dá)到顯著(P<0.05)水平，浸提料液比對(duì)紫小麥204W17和黑小麥202W20 2個(gè)品種麥綠素中蛋白質(zhì)含量的影響達(dá)到顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)水平，浸提時(shí)間對(duì)4個(gè)品種麥綠素中蛋白質(zhì)含量的影響均未達(dá)到顯著水平(P>0.05)?；邴溇G素中蛋白質(zhì)含量，4個(gè)品種彩粒小麥苗提取麥綠素優(yōu)選后的最優(yōu)工藝組合依次是：A1B3C3、A2B2C3、A2B3C3、A1B3C3。經(jīng)驗(yàn)證，山農(nóng)紫小麥和黑小麥202W20提取麥綠素中蛋白質(zhì)的最優(yōu)工藝均為A1B3C3，蛋白質(zhì)含量分別是47.72%和38.18%；黑小麥031244提取麥綠素中蛋白質(zhì)的最優(yōu)工藝是A2B3C3，蛋白質(zhì)含量是33.95%；紫小麥204W17提取麥綠素中蛋白質(zhì)的最優(yōu)工藝是A2B2C3，蛋白質(zhì)含量是49.04%。

以蛋白質(zhì)為指標(biāo)，4個(gè)品種彩粒小麥苗的麥綠素最佳提取工藝都不盡相同?？赡苁且?yàn)榈鞍踪|(zhì)不像類黃酮物質(zhì)一樣僅存在于胞基質(zhì)中，它還分布在細(xì)胞膜上，而4個(gè)品種彩粒小麥苗細(xì)胞結(jié)構(gòu)有所不同，所以蛋白質(zhì)的提取量更易受到溫度、提取時(shí)間以及料液比的影響。其次，在測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)，也受到環(huán)境溫度的影響。溫度的高低決定著染液蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成速度，并隨著試劑溫度的升高，復(fù)合物吸光值也會(huì)增加。再者，由于考馬斯亮藍(lán)染液有兩種不同顏色形式的光譜重疊，隨著更多的染液和蛋白質(zhì)結(jié)合，試劑的背景值不斷地減少，這些因素都會(huì)引起蛋白質(zhì)含量的差異以及工藝的不同。

表5 蛋白質(zhì)含量的方差分析Table 5 Analysis of variance of the content of protein

2.3 不同品種彩粒小麥苗麥綠素中SOD酶活性比較

表6 SOD酶活性的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Orthogonal test results of SOD activity U/100 g

續(xù) 表

由表6正交試驗(yàn)結(jié)果可知，在實(shí)測(cè)9組中，4個(gè)品種彩粒小麥苗提取麥綠素中SOD酶活性的最佳工藝組合都是A3B3C2，SOD酶活性范圍在1103～1867 U/100 g之間。由LSR最小極差分析可知，浸提溫度(A)、浸提時(shí)間(B)和浸提料液比(C)3個(gè)因素對(duì)4個(gè)品種彩粒小麥苗麥綠素中SOD酶活性的影響次序相同，均是A>B>C。經(jīng)SSR方差分析(見表7)表明，浸提溫度對(duì)4個(gè)品種彩粒小麥苗麥綠素中SOD活性的影響均達(dá)到顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)水平，浸提時(shí)間對(duì)山農(nóng)紫小麥和紫小麥204W17 2個(gè)品種麥綠素中SOD活性的影響達(dá)到顯著(P<0.05)水平，浸提料液比對(duì)4個(gè)品種小麥苗麥綠素中SOD活性的影響均不顯著(P>0.05)?；邴溇G素中SOD酶活性，4個(gè)品種彩粒小麥苗提取麥綠素優(yōu)選后的最優(yōu)工藝組合依次是：A3B3C2、A3B1C2、A3B3C3、A3B2C1。經(jīng)驗(yàn)證，4個(gè)品種彩粒小麥苗提取麥綠素中SOD酶活性的最優(yōu)工藝均為A3B3C2，SOD酶活性依次是1865.3，1106.4，1250.7，1640.1 U/100 g。本研究中山農(nóng)紫小麥苗麥綠素中SOD含量最高，若要制備SOD可考慮選擇從該小麥苗中提取。

表7 SOD酶活性的方差分析Table 7 Analysis of variance of SOD activity

2.4 不同品種彩粒小麥苗的麥綠素含量評(píng)價(jià)

基于類黃酮、蛋白質(zhì)含量和SOD酶活性，為了便于比較4個(gè)品種彩粒小麥苗的麥綠素含量，將優(yōu)選后的不同品種彩粒小麥苗麥綠素提取工藝匯總，見表8。并依據(jù)公式評(píng)價(jià)指數(shù)=C蛋白質(zhì)+C類黃酮+CSOD/100，計(jì)算出4個(gè)品種彩粒小麥苗的麥綠素含量評(píng)價(jià)指數(shù)，見表8。結(jié)果表明，兩種紫小麥的麥綠素含量更高。

表8 4個(gè)品種彩粒小麥苗的麥綠素含量評(píng)價(jià)Table 8 Evaluation of barley green content of four varieties of color-grained wheat seedlings

3 結(jié)論

基于麥綠素中類黃酮、蛋白質(zhì)含量和SOD酶活性，采用水浸提法和正交試驗(yàn)對(duì)不同品種彩粒小麥苗麥綠素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化并做含量比較，結(jié)果表明，紫小麥204W17苗麥綠素中類黃酮和蛋白質(zhì)含量均最高，分別為40.21 mg/100 g和49.04%，其提取的最佳工藝條件為浸提溫度25 ℃，浸提時(shí)間2.0 h，浸提料液比1∶4；山農(nóng)紫小麥苗麥綠素中SOD含量最高，為1865.3 U/100 g，其提取的最佳工藝條件為浸提溫度30 ℃，浸提時(shí)間2.5 h，浸提料液比1∶3。綜合評(píng)價(jià)得出紫小麥204W17苗和山農(nóng)紫小麥苗的麥綠素含量更高。