紅曲菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)天然黃色素的條件優(yōu)化

管宏偉，劉婷婷，陳磊，許贛榮，張薄博

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，糖化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)

紅曲菌(Monascussp.)是一種小型的絲狀真菌，能產(chǎn)生多種重要的代謝產(chǎn)物，主要的包括紅曲色素、Monacolin 類物質(zhì)、γ-氨基丁酸以及多糖等[1-4]。其中紅曲色素被廣泛地用于食品著色，特別是在中國、日本以及其他東南亞國家[5]。紅曲色素是包括紅曲紅色素、紅曲黃色素、紅曲橙色素在內(nèi)的多種色素的混合物，作為與紅曲紅色素結(jié)構(gòu)類似的同系物中的紅曲橙色素和紅曲黃色素這2種天然色素，尚未工業(yè)化生產(chǎn)[6]。目前天然色素僅占市場(chǎng)份額的30%，其余為合成與半合成色素[7]。但是由于合成與半合成色素潛在的毒性與致癌性，使得天然來源的色素受到了人們?cè)絹碓蕉嗟年P(guān)注和喜愛。紅曲菌發(fā)酵生產(chǎn)色素又分為固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵。相比于固態(tài)發(fā)酵，液態(tài)發(fā)酵不易污染、培養(yǎng)條件易控制、生產(chǎn)效率高，更適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，但目前已工業(yè)化的液態(tài)發(fā)酵過程僅適用于紅曲紅色素，而具有廣泛應(yīng)用前景的紅曲黃色素由于技術(shù)水平的限制，尚未工業(yè)化生產(chǎn)[8-10]。雖然早期主要是以紅曲紅色素的形式被大眾接受，但隨著紅曲黃色素的研究深入，紅曲黃色素產(chǎn)品凸顯出了巨大的市場(chǎng)潛力[11]。因此，選育適合液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲黃色素的高產(chǎn)菌株，優(yōu)化培養(yǎng)條件，提高發(fā)酵水平，逐漸成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[12-14]。

近年來，紅曲黃色素的研究越來越受到關(guān)注，國內(nèi)外研究者通過發(fā)酵優(yōu)化的方式不同程度上提高了紅曲黃色素的產(chǎn)量。李瑞杰等使用紅色紅曲菌M-7為實(shí)驗(yàn)菌株，對(duì)液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)水溶性紅曲黃色素的條件進(jìn)行了優(yōu)化，使得水溶性黃色素色價(jià)達(dá)到5.56 U/mL[15]。ZHOU等通過響應(yīng)面的方法優(yōu)化了紅曲菌突變體MYM的培養(yǎng)基組成，使得水溶性黃色素色價(jià)達(dá)88.14 U/mL[16]。LV等使用紫色紅曲菌進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，通過在培養(yǎng)的第72 h添加5 g/L的司盤-80，醇溶性黃色素色價(jià)達(dá)到669.2 U/mL[12]。然而，已有的研究主要通過添加前體或效應(yīng)因子等方式來提高黃色素產(chǎn)量，在成本或操作上存在一定的不足之處。

本研究利用前期研究室建立的雙液相發(fā)酵方法為基礎(chǔ)[17]，主要通過設(shè)計(jì)合理的碳氮源種類和濃度、無機(jī)鹽添加量，調(diào)控液態(tài)發(fā)酵過程的初始pH、培養(yǎng)溫度等條件，來進(jìn)一步提高醇溶性紅曲黃色素的色價(jià)；此外，在優(yōu)化發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，通過分離純化，液質(zhì)聯(lián)用和核磁共振等手段解析黃色素分子結(jié)構(gòu)，本文在一定程度上為紅曲黃色素發(fā)酵水平的提高以及工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫色紅曲菌 sjs-6，本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種;玉米淀粉,上海塞翁福農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司;中鏈甘油酯,上海佑創(chuàng)實(shí)業(yè)有限公司;耐高溫α-淀粉酶,江蘇銳陽生物科技有限公司;(NH4)SO4、NaNO3、KH2PO4、K2HPO4、無水CaCl2、MgSO4，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-B11-360電熱恒溫培養(yǎng)箱，連云港醫(yī)療器械設(shè)備廠；HYL-C全溫?fù)u床柜，太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；GI100T高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；GEX-9240MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊醫(yī)療設(shè)備廠；CX31光學(xué)顯微鏡，日本奧林巴斯株式會(huì)社；waters 1525高效液相色譜，美國Waters公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基條件

紅曲菌，接種于PDA斜面，30 ℃避光培養(yǎng)7 d，4 ℃保藏。孢子懸浮液制備：利用無菌水將PDA斜面表層的孢子洗下，使孢子數(shù)達(dá)到1×107個(gè)/mL。種子培養(yǎng)基(g/L)：玉米淀粉 60，(NH4)2SO44，NaNO32，MgSO4·7H2O 0.5，CaCl20.1，K2HPO4·3H2O 2，KH2PO4·3H2O 2，F(xiàn)eSO41，用乳酸調(diào)pH值至5.0。分裝每瓶50 mL，121℃滅菌20 min。接種量為5 mL，30 ℃，180 r/min下培養(yǎng)2 d。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：玉米淀粉60， (NH4)2SO44，NaNO32， MgSO4·7H2O 0.5，CaCl20.1，K2HPO4·3H2O 2，KH2PO4·3H2O 2，F(xiàn)eSO41，用乳酸調(diào)pH值至5.0。分裝每瓶50 mL，每瓶添加萃取劑20 mL，121℃滅菌20 min。接種量為10%，30 ℃、180 r/min下培養(yǎng)7 d。

1.3.2 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

在初始培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別探討了碳源、氮源的種類與添加濃度，金屬離子Mg2+濃度以及初始pH和培養(yǎng)溫度對(duì)紅曲菌產(chǎn)黃色素的影響。

1.3.3 檢測(cè)方法

1.3.3.1 色價(jià)檢測(cè)方法

取適量發(fā)酵液進(jìn)行離心，離心條件為 6 000 r/min、 10 min，使萃取相與發(fā)酵液及菌體分離。取1 mL萃取相置于50 mL比色管內(nèi)，用無水乙醇進(jìn)行稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，進(jìn)行全波長掃描，波長為300～600 nm，計(jì)算萃取相中色素色價(jià)及色調(diào),如公式(1)、(2)所示(色價(jià)計(jì)算時(shí)，黃色素取OD410 nm，橙色素取OD460 nm， 紅色素取OD510 nm)：

發(fā)酵液色價(jià)/(U·mL-1)

(1)

(2)

1.3.3.2 菌體量檢測(cè)方法

將發(fā)酵液充分振蕩搖勻后，取適量發(fā)酵液進(jìn)行離心，離心條件為6 000 r/min、 10 min， 輕輕吸去上層萃取相，留下層。以適量蒸餾水洗滌后用烘干的濾紙進(jìn)行抽濾，50℃烘干水分至恒重，計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

式中：A為菌體量，g/L；V為所取的發(fā)酵液的體積，mL；m1為烘干后菌絲體與濾紙的總質(zhì)量，g；m2為濾紙的質(zhì)量，g。

1.3.3.3 發(fā)酵液pH測(cè)定

取適量發(fā)酵液進(jìn)行離心，離心條件為6 000 r/min、10 min，輕輕吸去上層萃取相。用標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液校準(zhǔn)精密數(shù)字酸度計(jì)，校準(zhǔn)完成后，用去離子水清洗酸度計(jì)，擦凈，測(cè)定待測(cè)發(fā)酵液的pH， 等讀數(shù)穩(wěn)定即可記錄數(shù)據(jù)。

1.3.3.4 紅曲黃色素提取與分析方法

取適量發(fā)酵液進(jìn)行離心，離心條件為6 000 r/min、10 min，取上層萃取相與體積分?jǐn)?shù)為85%乙醇以1∶4體積比混合，倒入分液漏斗中，劇烈振蕩后靜置，待分層后取上層。將上層液體倒入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀的蒸餾燒瓶內(nèi)，以溫度50 ℃、轉(zhuǎn)速100 r/min的條件進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸干，直至無液體蒸出。取出蒸干后的黃色素粗品再次進(jìn)行離心，離心條件為6 000 r/min、10 min，取上層，避光保存于-20 ℃。

將提取的黃色素用無水乙醇稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)后使用分析型高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)，并使用分析性高效液相色譜制取一定量的黃色素純品。取2 mL制備型高效液相色譜收集液，通過液質(zhì)聯(lián)用分析紅曲黃色素的相對(duì)分子質(zhì)量，并采用核磁共振解析紅曲黃色素的結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮源種類對(duì)紅曲菌液態(tài)發(fā)酵黃色素產(chǎn)量的影響

氮源作為微生物生長代謝必不可少的營養(yǎng)成分，在紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)色素過程中起著至關(guān)重要的作用。PISAREVA等通過研究發(fā)現(xiàn)，尿素是作為紅曲菌發(fā)酵生產(chǎn)色素的最佳氮源[18]。而也有研究表示，蛋白胨在紅曲菌發(fā)酵過程中顯著促進(jìn)了紅曲色素的合成，是紅曲色素合成的最有利的氮源之一[19-21]。由此可見，紅曲菌發(fā)酵生產(chǎn)色素的最優(yōu)氮源具有菌株特異性。我們分別選取(NH4)2SO4、NH4NO3、檸檬酸銨、NH4Cl、牛肉浸膏、魚粉蛋白胨、酵母浸膏、酵母浸粉8種氮源進(jìn)行優(yōu)化，紅曲黃色素色價(jià)及菌體量如圖1-a所示。以無機(jī)氮源為唯一氮源時(shí)，黃色素色價(jià)因氮源種類不同而出現(xiàn)明顯的差異，其中以NH4NO3為氮源時(shí)，黃色素色價(jià)僅為32.84 U/mL，菌體量也較低，僅為5.61 g/L；以(NH4)2SO4為氮源時(shí)，黃色素色價(jià)能夠達(dá)到344.06 U/mL，在此條件下，紅曲菌sjs-6菌體生長狀況良好，菌體量超過20 g/L。以有機(jī)氮源為唯一氮源時(shí)，黃色素色價(jià)一般為200 U/mL左右，彼此間差距較小。由結(jié)果可知，以(NH4)2SO4為氮源時(shí)更有利于紅曲黃色素生產(chǎn)。

圖1-b中顯示的是不同條件下，紅曲菌色素產(chǎn)物在300～600 nm的吸收峰，其中黃色素的代表峰為(410±10)nm，橙色素的代表峰為(460±10)nm，紅色素的代表峰為(510±10)nm。由此可見，紅曲菌在不同氮源的條件下合成的主要色素成分是不一樣的，以有機(jī)氮源(圖1-a, 圖1-b中E～H)為唯一氮源時(shí)，紅曲菌sjs-6主要合成橙色素，其色價(jià)高于黃色素，黃色素的色調(diào)值小于1；無機(jī)氮源對(duì)紅曲菌合成色素的影響不一致，當(dāng)以無機(jī)氮源(NH4)2SO4(圖1-a, 圖1-b中A)為唯一氮源時(shí)，黃色素的色調(diào)超過1，此時(shí)紅曲菌所產(chǎn)色素主要以黃色素為主。由此可見，通過調(diào)節(jié)氮源的種類能夠顯著改變紅曲菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生色素的主要色調(diào)，本文以黃色素為研究目標(biāo)，因此，選擇(NH4)2SO4為氮源進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

A-(NH4)2SO4；B-NH4NO3；C-檸檬酸銨；D-NH4Cl；E-牛肉浸膏；F-魚粉蛋白胨；G-酵母浸膏；H-酵母浸粉a-氮源種類對(duì)紅曲菌生長、色素產(chǎn)量及黃色素色調(diào)的影響；b-氮源種類對(duì)紅曲色素萃取液吸收峰的影響

2.2 碳源種類對(duì)紅曲菌液態(tài)發(fā)酵黃色素產(chǎn)量的影響

碳源與氮源一樣是影響微生物發(fā)酵的重要因素，TZANN等通過研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖及其低聚糖和多糖在紅曲菌生長和色素生成方面均優(yōu)于其他碳源[22]，而也有報(bào)導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，半乳糖和乙醇更適合作為碳源用于紅曲菌發(fā)酵產(chǎn)色素[1,23]?？梢?，與氮源類似，紅曲菌發(fā)酵的最優(yōu)碳源也具有菌株特異性。分別選取葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、玉米淀粉、大米粉和甘油7種碳源進(jìn)行優(yōu)化，黃色素色價(jià)及紅曲菌菌體量如圖2-a所示。結(jié)果表明，不同碳源條件下菌體生長強(qiáng)度表現(xiàn)為：大米粉>玉米淀粉>麥芽糖>蔗糖>果糖>葡萄糖>甘油；不同碳源條件下黃色素合成能力為：麥芽糖>甘油>蔗糖>果糖>葡萄糖>大米粉>玉米淀粉。以多糖(大米粉、玉米淀粉)為碳源時(shí)，紅曲菌的菌體量明顯增加，但黃色素色價(jià)偏低，其中以玉米淀粉作為唯一碳源時(shí)，黃色素色價(jià)最低，僅為147.31 U/mL；以二糖(麥芽糖、蔗糖)為碳源時(shí)，黃色素色價(jià)較高，尤其是以麥芽糖為唯一碳源時(shí)，黃色素色價(jià)達(dá)到358.84 U/mL。這可能是因?yàn)辂溠刻菫槎?，發(fā)酵過程中紅曲菌自身能夠合成相關(guān)酶類，催化麥芽糖緩慢分解生成單糖，使發(fā)酵液中單糖濃度持續(xù)維持在較適宜的水平，既避免了菌體大量生長，同時(shí)又促進(jìn)了紅曲黃色素的合成與積累。可知，紅曲菌sjs-6生產(chǎn)紅曲黃色素的最佳碳源為麥芽糖。

由圖2-b可見，當(dāng)使用不同種類的碳源時(shí)，紅曲菌合成的色素吸收峰主要集中在420 nm左右，未發(fā)生明顯的波峰遷移，說明與氮源影響因素相比，碳源種類只對(duì)黃色素的產(chǎn)量產(chǎn)生一定的影響，對(duì)產(chǎn)色素種類幾乎無影響。為了研究碳源種類對(duì)紅曲色素色調(diào)的影響，分別測(cè)定黃色素、紅色素、橙色素的色價(jià)，計(jì)算色素色調(diào)，結(jié)果如圖2-a所示。當(dāng)以麥芽糖、大米粉為碳源時(shí)，色素色調(diào)值大于1，此時(shí)紅曲菌sjs-6主要生產(chǎn)黃色素，其產(chǎn)量遠(yuǎn)高于其他色素成分；當(dāng)以葡萄糖、果糖、蔗糖、玉米淀粉、甘油為碳源時(shí)，紅曲菌sjs-6液態(tài)發(fā)酵得到的黃色素的產(chǎn)量低于其他色素之和；由此可見，當(dāng)以麥芽糖為紅曲菌發(fā)酵的碳源時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物以黃色素為主，且色價(jià)最高。

A-葡萄糖；B-果糖；C-麥芽糖；D-蔗糖；E-玉米淀粉；F-大米粉；G-甘油a-碳源種類對(duì)紅曲菌生長、色素產(chǎn)量及黃色素色調(diào)的影響；b-碳源種類對(duì)紅曲色素萃取液吸收峰的影響

2.3 氮源添加量對(duì)紅曲菌液態(tài)發(fā)酵黃色素產(chǎn)量的影響

以(NH4)2SO4為唯一氮源，分別選擇6種不同氮源添加量(2、4、6、8、10、12 g/L)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。紅曲菌菌體量及黃色素色價(jià)如圖3所示，當(dāng)?shù)刺砑恿坑? g/L 增長至6 g/L時(shí)，紅曲菌的菌體量由8.28 g/L增長至13.28 g/L，相應(yīng)的黃色素色價(jià)也呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)；當(dāng)?shù)刺砑恿扛哂? g/L，紅曲菌菌體量趨于穩(wěn)定狀態(tài)，而黃色素色價(jià)持續(xù)上升，直至氮源添加量為10 g/L時(shí)，黃色素色價(jià)達(dá)到最高值；當(dāng)?shù)刺砑恿坷^續(xù)由10 g/L增長至12 g/L時(shí)，黃色素色價(jià)反而降低。由此可知，(NH4)2SO4的最優(yōu)添加量為10 g/L。

研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程中氮源添加量不同，紅曲菌色素的色調(diào)也會(huì)改變。圖3中顯示出紅曲色素色調(diào)的相應(yīng)變化，可見，當(dāng)?shù)刺砑恿繛? g/L時(shí)，紅曲菌合成其他色素量高于黃色素，色素色調(diào)值低于1；當(dāng)?shù)刺砑恿繌? g/L增至10 g/L時(shí)，色素色調(diào)值由1.0增至1.2，紅曲菌主要合成黃色素；當(dāng)?shù)刺砑恿砍^10 g/L時(shí)，色素色調(diào)值略有下降，紅曲菌仍以黃色素為主產(chǎn)物，但其他色素的合成比率上升。由結(jié)果可知，10 g/L為紅曲菌液態(tài)發(fā)酵的最佳氮源添加量。

圖3 氮源添加量對(duì)紅曲菌生長、色素產(chǎn)量及黃色素色調(diào)影響

2.4 碳源添加量對(duì)紅曲菌液態(tài)發(fā)酵黃色素產(chǎn)量的影響

以麥芽糖為唯一碳源，分別選擇5種不同添加量20、40、60、80、100 g/L進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，紅曲菌菌體量及紅曲黃色素色價(jià)如圖4所示。當(dāng)碳源添加量為20 g/L時(shí)，紅曲菌菌體量及黃色素色價(jià)均處于較低水平；當(dāng)碳源添加量由40 g/L增長至80 g/L時(shí)，紅曲菌生長代謝過程得到充足的碳源，菌體量逐漸穩(wěn)定于14 g/L左右，黃色素色價(jià)持續(xù)上升；當(dāng)碳源添加量為80 g/L時(shí)，黃色素色價(jià)最高，達(dá)到427.65 U/mL；當(dāng)碳添加量繼續(xù)由80 g/L增長至100 g/L時(shí)，黃色素色價(jià)反而隨之降低。

不同的碳源添加量對(duì)紅曲黃色素色調(diào)有著一定影響，當(dāng)碳源添加量由20 g/L增至100 g/L時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物中紅、橙、黃3種色素的色價(jià)有所變化，但黃色素色調(diào)值始終大于1.0，表明紅曲菌主要合成黃色素。綜上結(jié)果，紅曲菌生產(chǎn)黃色素的最佳碳源添加量為80 g/L。

圖4 碳源添加量對(duì)紅曲菌生長、色素產(chǎn)量及黃色素色調(diào)的影響

2.5 Mg2+添加量對(duì)紅曲菌液態(tài)發(fā)酵黃色素產(chǎn)量的影響

金屬離子，尤其是Mg2+，對(duì)紅曲菌生長和色素生產(chǎn)有極大的影響，有研究表明，當(dāng)Mg2+質(zhì)量濃度在0.06～0.96 g/L時(shí)，隨著Mg2+濃度的增加，紅曲色素的產(chǎn)量也隨之出現(xiàn)明顯的提高[22]。本實(shí)驗(yàn)以MgSO4為Mg2+來源，分別選擇4種不同添加量0.5、1.0、1.5、2.0 g/L，對(duì)Mg2+添加量進(jìn)行優(yōu)化，紅曲菌菌體量及黃色素色價(jià)如圖5所示。當(dāng)Mg2+添加量由0.5 g/L增至1.0 g/L時(shí)，黃色素色價(jià)由244.14 U/mL增長至333.79 U/mL，紅曲菌菌體量由9.94 g/L上升至11.31 g/L；當(dāng)Mg2+添加量繼續(xù)增加時(shí)，不利于紅曲菌的生長及黃色素的合成，可能是由于此時(shí)Mg2+濃度過高，抑制了紅曲色素相關(guān)合成酶的活力。由實(shí)驗(yàn)可知，最佳Mg2+添加量為1.0 g/L，在此條件下黃色素色價(jià)最高。

同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，Mg2+添加量能夠影響紅曲菌合成色素的色調(diào)。當(dāng)Mg2+添加量由0.5 g/L增至2.0 g/L時(shí)，紅曲黃色素的色調(diào)值有所下降，但始終大于1.0，表明紅曲菌主要合成黃色素；當(dāng)Mg2+添加量為0.5 g/L時(shí)，黃色素色調(diào)值最高，此時(shí)黃色素的產(chǎn)量約為其他兩種色素產(chǎn)量的1.89倍。綜合考慮色價(jià)的結(jié)果，選擇Mg2+添加量為1.0 g/L。

圖5 Mg2+添加量對(duì)紅曲菌生長、色素產(chǎn)量及黃色素色調(diào)的影響

2.6 初始pH對(duì)紅曲菌液態(tài)發(fā)酵黃色素產(chǎn)量的影響

一般來說，紅曲菌生長和色素生產(chǎn)的較適pH為4.0～7.0，不同pH的培養(yǎng)基可能會(huì)影響紅曲色素組成，YONGSMITH等發(fā)現(xiàn)，在初始pH 7.0的條件下Monascussp. KB 10合成橙紅色的色素混合物，在初始pH低于4時(shí)Monascussp. KB 10產(chǎn)生淺金色的色素混合物[24]。CHEN等也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH值低于4時(shí)，M.purpureusUQM 192F產(chǎn)黃色素ankaflavin的能力顯著提高[19]。本實(shí)驗(yàn)以乳酸進(jìn)行pH調(diào)節(jié)，分別選擇6種不同初始pH(3、4、5、6、7、8)，研究發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH對(duì)紅曲菌生長及黃色素產(chǎn)量的影響。紅曲菌菌體量及黃色素色價(jià)如圖6所示，當(dāng)發(fā)酵液pH過低或過高(處于3或8)時(shí)，紅曲菌生長受到抑制，菌體量偏低，對(duì)應(yīng)的黃色素色價(jià)也較低。尤其是當(dāng)pH為3時(shí)，黃色素色價(jià)僅為111.01 U/mL；當(dāng)pH在4～7時(shí)，紅曲菌生長狀況較好，菌體量穩(wěn)定于12 g/L左右，各實(shí)驗(yàn)組黃色素色價(jià)均大于400 U/mL。其中pH為6時(shí)，黃色素色價(jià)最高，達(dá)到444.44 U/mL。因此紅曲菌液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)黃色素的最佳初始pH為6。

不同初始pH的培養(yǎng)基會(huì)影響紅曲黃色素色調(diào)，初始pH值為3時(shí)黃色素產(chǎn)量低于其他色素之和，黃色素色調(diào)小于1.0；當(dāng)初始pH在4～8范圍內(nèi)時(shí)，黃色素色調(diào)均大于1.0，紅曲菌主要合成黃色素，尤其是當(dāng)初始pH值為7時(shí)，黃色素產(chǎn)量為其他色素產(chǎn)量的1.33倍，黃色素色調(diào)值最高。

圖6 初始pH對(duì)紅曲菌生長、色素產(chǎn)量及黃色素色調(diào)的影響

2.7 培養(yǎng)溫度對(duì)紅曲菌液態(tài)發(fā)酵黃色素產(chǎn)量的影響

一般來說，紅曲菌在25～30℃下培養(yǎng)適合菌體的生長及色素的生產(chǎn)，不同的培養(yǎng)溫度對(duì)紅曲菌的色素合成有著顯著的影響，如AHN等報(bào)道，當(dāng)Monascussp. J101在25 ℃下培養(yǎng)時(shí)，紅曲紅色素產(chǎn)量比30 ℃時(shí)高10倍[25]。本實(shí)驗(yàn)選取26、28、30、32、3 4℃5種培養(yǎng)溫度，研究培養(yǎng)溫度對(duì)紅曲菌生長及黃色素產(chǎn)量的影響。紅曲菌菌體量及黃色素色價(jià)如圖7所示。當(dāng)培養(yǎng)溫度由26℃增至30℃時(shí)，紅曲菌菌體量由6.81 g/L增至13.59 g/L，相應(yīng)的黃色素色價(jià)由254.22 U/mL顯著增至508.61 U/mL；當(dāng)培養(yǎng)溫度繼續(xù)提高，紅曲菌的菌體量仍較為穩(wěn)定(13 g/L左右)，而黃色素色價(jià)則呈現(xiàn)較為明顯的下降趨勢(shì)。因此，30℃為紅曲菌sjs-6菌體生長和黃色素合成的最佳培養(yǎng)溫度。

不同培養(yǎng)溫度對(duì)紅曲黃色素色調(diào)也有一定的影響，隨著培養(yǎng)溫度升高(26～34 ℃)，黃色素色調(diào)值呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。當(dāng)培養(yǎng)溫度較低(<30 ℃)時(shí)，紅曲色素色調(diào)值低于1.0；當(dāng)培養(yǎng)溫度超過30 ℃時(shí)，紅曲色素色調(diào)值大于1.0，此時(shí)紅曲菌合成黃色素量超過其他色素之和。由此可知，通過控制培養(yǎng)溫度，能夠有效減少其他色素合成，提高黃色素合成比例。

圖7 培養(yǎng)溫度對(duì)紅曲菌生長、色素產(chǎn)量及黃色素色調(diào)的影響

2.8 紅曲黃色素結(jié)構(gòu)解析

將發(fā)酵結(jié)束后的紅曲黃色素進(jìn)行提取之后，使用分析型高效液相色譜進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)圖譜如圖8-b所示。其峰為單一組分，從峰面積歸一化計(jì)，占樣品總量的97.18%。之后使用制備型高效液相色譜對(duì)該組分進(jìn)行純化制備，以液質(zhì)聯(lián)用法對(duì)已純化的紅曲黃色素的相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定，由圖8-c可清晰地看出M+H(分子質(zhì)量為359.1)的準(zhǔn)分子離子峰，確定其相對(duì)分子質(zhì)量為358 Da，與文獻(xiàn)報(bào)道中的一種主要的紅曲黃色素-紅曲素(monascin)的分子質(zhì)量一致。經(jīng)核磁共振分析得知，該黃色素有26個(gè)氫，21個(gè)碳，包括3個(gè)羰基碳、3個(gè)甲基碳、3個(gè)亞甲基碳、5個(gè)次甲基碳以及4個(gè)季碳。以上信息與文獻(xiàn)報(bào)道中的紅曲素完全一致[26]，確定紅曲菌sjs-6在實(shí)驗(yàn)室條件下發(fā)酵生產(chǎn)的黃色素為紅曲素，分子式為C21H26O5。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以高產(chǎn)黃色素的紫色紅曲菌sjs-6為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過優(yōu)化使黃色素色價(jià)達(dá)到508.61 U/mL，較未優(yōu)化前提高了52%。并通過計(jì)算黃色素色調(diào)值的方法，更直觀地展示出黃色素的占比及其變化趨勢(shì)。此外，在優(yōu)化發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，通過分離純化、液質(zhì)聯(lián)用和核磁共振等手段解析黃色素分子結(jié)構(gòu)。然而，目前的研究仍處于搖瓶水平，在發(fā)酵罐放大過程中仍有許多需要解決的問題。計(jì)劃下階段以目前優(yōu)化的結(jié)果為基礎(chǔ)，進(jìn)一步通過代謝調(diào)控的方式，提高紅曲黃色素的產(chǎn)量，并逐步在發(fā)酵罐中進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)，為實(shí)現(xiàn)紅曲黃色素的工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

a-紅曲素結(jié)構(gòu)式;b-紅曲色素高效液相圖譜;c-純化后的紅曲黃色素質(zhì)譜圖;d-純化后的紅曲黃色素13CNMR；e-1HNMR