陸積新 李近都 潘興壽 李天資 鄒才華 曾德創(chuàng) 梁燁

[摘要]目的 探討石斛多糖對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）炎癥因子和晚期糖基化終產(chǎn)物代謝的效果及其劑量。方法 提取石斛多糖，將SHR隨機(jī)分為對(duì)照組、低劑量組、中劑量組和高劑量組四組，對(duì)照組給開水，低劑量組、中劑量組和高劑量組分別給石斛多糖100、300、500mg/d，干預(yù)2個(gè)月，比較干預(yù)后各組腫瘤壞死因子（TNF-α），白細(xì)胞介素（IL）-6，IL-10，晚期糖基化終產(chǎn)物（AGE），可溶性AGE受體（sRAGE）和全長AGE受體（RAGE）mRNA水平。結(jié)果 與對(duì)照組比較，低劑量組TNF-α水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)意義（P<0.05），中劑量組TNF-α、IL-6和IL-10水平差異有統(tǒng)計(jì)意義（P<0.05），高劑量組TNF-α、IL-6和IL-10水平差異有統(tǒng)計(jì)意義（P<0.05）。低劑量組sRAGE水平差異有統(tǒng)計(jì)意義（p<0.05），中劑量組sRA（-.E和RACE mRNA水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)意義（P<0.05），高劑量組AGE、sRAGE和RAGE mRNA水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)意義cP<0.05）。石斛多糖能夠有效緩解SHR的炎癥因子和晚期糖基化終產(chǎn)物代謝紊亂。其改善TNF-α、IL-6、IL-10、AGE、sRAGE和RAGE mRNA的作用有劑量效應(yīng)關(guān)系，糾正SHR炎癥因子功能紊亂的有效劑量為300mg/d;糾正SHR晚期糖基化終末產(chǎn)物及其受體功能紊亂的有效劑量為500mg/d。結(jié)論 石斛多糖可有效緩解SHR的炎癥因子功能紊亂，降低AGE水平，提高sRAGE水平，降低RAGE基因的活化，對(duì)緩解SHR的血管重塑有積極的作用。其藥效有劑量效應(yīng)關(guān)系，中等劑量可有效改善炎癥癥狀，高劑量能改善AGE及其受體癥狀。

[關(guān)鍵詞]石斛多糖;炎癥因子;晚期糖基化終產(chǎn)物;晚期糖基化終產(chǎn)物受體

[中圖分類號(hào)]R285.5

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]2095-0616（2020）01-09-05

晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycationendproducts，AGE）能夠和身體的組織細(xì)胞相組合，導(dǎo)致慢性退化型疾病的發(fā)生，是全球醫(yī)學(xué)界最為熱門的領(lǐng)域之一，AGE受體（receptor for advancedglycation end-product，RAGE）是細(xì)胞表面分子的免疫球蛋白超家族成員之一，與AGE及蛋白質(zhì)分子相互作用參與炎癥反應(yīng)，高水平的AGE可促進(jìn)RAGE的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與促進(jìn)AS的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)[1]?？扇苄訰AGE（soluble receptor foradvanced glycationend products， sRAGE） 與RAGE結(jié)構(gòu)相似，可競爭性地與AGE結(jié)合，對(duì)保護(hù)血管細(xì)胞，改善AS進(jìn)程有積極的作用，成為臨床藥學(xué)關(guān)注的熱點(diǎn)[2]。石斛（dendrobium）含有豐富的酚類、類萜類和含氮類等重要藥用成分，具有滋陰清熱，抑制炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)免疫力等功效，在AS中發(fā)揮了積極的作用，但其作用的靶點(diǎn)及其機(jī)制還不完全清楚[3]。為探討石斛對(duì)AS的療效及其機(jī)制，本研究觀察石斛多糖干預(yù)SHR后其腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-10、AGE、sRAGE和腹主動(dòng)脈平滑肌RAGE mRNA表達(dá)水平的變異情況。

1 材料與方法

1.1鐵皮石斛多糖

采用人工栽培鐵皮石斛（廣西根遼生物技術(shù)有限公司提供），經(jīng)本校何思陸主任藥師鑒定為鐵皮石斛（Dendrobium candidum）。鐵皮石斛多糖提取按文獻(xiàn)[4]：取新鮮品鐵皮石斛莖1000g，100℃殺青30min，60℃烘箱烘干24h，100目粉碎機(jī)粉碎，80℃熱水浸提2h，離心、抽濾、濃縮至原有體積的1/6，醇沉24h，離心，真空干燥。熱水回流加纖維素酶（Cellulase）純化，水浴加熱濃縮至含生藥量為1g/100mL的藥液，殺菌，貯存于4℃冰箱內(nèi)備用。

1.2動(dòng)物喂養(yǎng)與藥飼

（1）自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）和飼料：SHR由中山大學(xué)北校園實(shí)驗(yàn)動(dòng)物巾心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK（粵）2017-0081。選購2個(gè)月±2d齡雄性SHR大鼠48只，普通級(jí)。鼠飼料丸由上海新奇特種飼料廠提供。（2）喂養(yǎng)方法：鼠飼料丸架式籠養(yǎng)，室溫（20±2）℃，相對(duì)濕度（75±5）%，光照明暗各12h交替，喂養(yǎng)至8個(gè)月±2d月齡，平均體重為（352+5）g時(shí)給予藥物干預(yù)。（3）分組藥飼：將48只SHR大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、低劑量組、巾劑量組和高劑量組四組，每組12只共一籠飼養(yǎng)。（4）藥物劑量：根據(jù)2010年版《中國藥典》成人70kg推薦劑量10g/d，SHR體重0.35kg，按照人用量推算動(dòng)物給藥量，SHR等效劑量約為人的6.3倍，本研究用石斛劑量為：低劑量組100mg/d，中劑量組300mg/d，高劑量組500mg/d。（5）給藥方法：低劑量組口腔給石斛多糖藥飲100mg/d（取10.0mL藥液加水40mL）;巾劑量組口腔給石斛多糖藥飲300mg/d（取30.0mL藥液加水10mL）;高劑量組口腔給石斛多糖藥飲500mg/d（取50.0mL藥液），每天1次。對(duì)照組口腔給開水50.0mL/d。四組均等量喂鼠飼料丸，飲用水自由飲用，連續(xù)2個(gè)月。

1.3標(biāo)本采集

于干預(yù)后麻醉SHR進(jìn)行標(biāo)本采集。（1）麻醉方法：碘伏消毒，以10%水合氯醛3mL/kg腹腔注射麻醉大鼠。（2）血液標(biāo)本采集：剃去腹部的毛，解剖，切腹壁打開腹腔，從腹腔靜脈取血0.5mL，低溫分離取血清。（3）標(biāo)本采集：剪取腹主動(dòng)脈平滑肌15mm×3mm組織，剪成5mm×3mm共3小塊，分別置于3個(gè)凍存管，于30min內(nèi)液氮固定4h，移至-70℃冰箱保存?zhèn)錂z。

1.4標(biāo)本檢測(cè)

TNF-α、IL-6、IL-10和sRAGE測(cè)定用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法，試劑盒由杭州沃森生物技術(shù)有限公司提供，用美國BIO RAD 550型酶標(biāo)儀檢測(cè)，嚴(yán)格按檢測(cè)方法和程序進(jìn)行。

1.5RAGE mRNA表達(dá)檢測(cè)

用RT-PCR法，取100μL腹肌勻漿，用Trizol試劑提取總RNA，氯仿和異丙醇抽提。紫外分光光度儀和瓊脂糖電泳鑒定RNA的濃度和純度，取10μL，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-70℃凍存?zhèn)溆?。?μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，并以β-actin為內(nèi)參對(duì)照。根據(jù)Gene Bank人類RAGE基因（Gene Bank登錄號(hào)AB036432）設(shè)計(jì)RAGE基因引物，由杭州聯(lián)川生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。RAGE基因序列為F：5'一GGGGTACCAAGGAAGCAGGTAGGCAGCC-3';R：5'-CCGCTCGAATCCATTCCTGTTCATCTGC-3'，擴(kuò)增長度328bp。管家基因序列為F：5'-TCCTAGCACCATGAAGATC-3';R：5'一AAACGCAGCTCAGTAACAG-3'，擴(kuò)增長度225bp。PCR反應(yīng)條件：55℃逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)60min，94℃變性2min→94℃30s→55℃30s→72℃1min，共30循環(huán)，72℃延伸7min。膠回收試劑盒回收目的基因片段。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠巾電泳，凝膠成像儀采集圖像，PCR儀獲得產(chǎn)物Ct值，采用2-△△Ct相對(duì)定量計(jì)算公式計(jì)算分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS20.0版本軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以（χ±s）表示。兩組資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組資料比較采用單因素方差分析，組間比較用LSD檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1石斛多糖對(duì)SHR血清TNF-α、IL-6和IL-10水平的影響

與對(duì)照組比較，低劑量組TNF-α水平差異有統(tǒng)計(jì)意義（P<0.01），巾劑量組TNF-α、IL-6和IL-10水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01或P<0.05），高劑量組TNF-α、IL-6和IL-10水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與低劑量組比較，巾劑量組TNF-α水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），高劑量組TNF-α、IL-6和IL-10水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01或P<0.05）。與巾劑量比較，高劑量組TNF-α和IL-6水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。提示石斛多糖能有效糾正炎癥功能紊亂，表現(xiàn)為降低TNF-α和IL-10水平，提高IL-6水平，治療SHR炎癥因子的有效劑量為石斛多糖300mg/d，連用2個(gè)月。將劑量提高到500mg/d，其糾正炎癥功能紊亂效果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.2石斛多糖對(duì)SHR血清AGE、sRAGE水平和動(dòng)脈平滑肌組織RAGE mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，低劑量組sRAGE水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），中劑量組sRAGE和RAGE mRNA水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01或P<0.05），高劑量組AGE、sRAGE和RAGE mRNA水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與低劑量組比較，巾劑量組sRAGE水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），高劑量組AGE、sRAGE和RAGE mRNA水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與巾劑量組比較，高劑量組AGE、sRAGE和RAGE mRNA水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。提示石斛多糖能有效糾正晚期糖基化終末產(chǎn)物及其受體功能紊亂，表現(xiàn)為提高sRAGE水平，降低AGE和RAGE mRNA水平。石斛多糖有效糾正SHR AGE及其受體功能紊亂的有效劑量為500mg/d，連用2個(gè)月。見表2。

3 討論

有關(guān)糖基化產(chǎn)物（AGE）及其特異性受體（RAGE）的結(jié)構(gòu)及其對(duì)各種疾病病理機(jī)制作用的共識(shí)正在不斷更新，AGE是一種對(duì)機(jī)體有害的高度活性的羰基化合物，營養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)過美拉德（Maillard）反應(yīng)產(chǎn)生的終末產(chǎn)物，AGE在非酶促條件下，營養(yǎng)物質(zhì)中的蛋白質(zhì)、氨基酸、脂類或核酸等大分子游離的氨基與還原糖的醛基經(jīng)過縮合、重排、裂解、氧化修飾后等美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的，首先大分子末端的還原性氨基與還原糖分子中的醛基發(fā)生加成反應(yīng)，形成希夫堿（Schiff bases），其次希夫堿再發(fā)生阿馬道里（Amadori）重排，形成早期糖基化產(chǎn)物醛胺類，再次醛胺類再經(jīng)過脫水，重排反應(yīng)生成乙二酸（草酸），3-脫氧葡萄糖醛酮（3-DG）和甲基乙二醛（丙酮醛）等AGE[5]。體內(nèi)AGE的主要來源一是食物中存在通過進(jìn)食將AGE攝入體內(nèi)，另外當(dāng)體內(nèi)葡萄糖濃度異常增高時(shí)，體內(nèi)AGE的合成加速，分解減緩[6]。當(dāng)AGE異常增高時(shí)，細(xì)胞表面的RAGE與AGE配體相互作用產(chǎn)生效應(yīng)，導(dǎo)致許多慢性退化型疾病的發(fā)生[7]。人類RAGE編碼基因位于6號(hào)染色體上，包含11個(gè)外顯子和10個(gè)較短的內(nèi)含子[8]。RAGE是一類模式識(shí)別受體，正常情況下RAGE表達(dá)量很低，當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)AGE聚集，RAGE表達(dá)量上調(diào)，激活如磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol3 kinase，PI3K）、分裂原激活的蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases.MAPK）、應(yīng)激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase，SAPK）、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducers and activatorsof transcription，STAT）等多種信號(hào)傳導(dǎo)通路的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，激活下游核轉(zhuǎn)錄因子（NK-K B）等，調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，炎癥因子釋放，導(dǎo)致血管通透性增高，單核細(xì)胞粘附，基質(zhì)成分增多等病理變化，在動(dòng)脈粥樣硬化損傷的發(fā)生發(fā)展巾發(fā)生作用[9]。研究認(rèn)為，AGE與RAGE配體結(jié)合后，RAGE將信號(hào)傳遞至胞內(nèi)，從而引發(fā)由氧自由基、蛋白酪氨酸激酶、蛋白激酶C、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶、p38絲裂原蛋白激酶和NF-KB等構(gòu)成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[10]。雖然AGE與RAGE配體結(jié)合后RAGE首先與哪種蛋白結(jié)合，目前還不完全清楚，但對(duì)RAGE多聚核糖體mRNA研究發(fā)現(xiàn)，RAGE有3種主要的剪接變異體，分別為全長膜結(jié)合型（RAGE）、截去C端可溶型（sRAGE）和截去N端膜結(jié)合型。RAGE有完整的胞外段、膜鑲嵌區(qū)和胞內(nèi)段;sRAGE為RAGE的胞外段部分，缺少跨膜鑲嵌區(qū)和胞內(nèi)段;膜結(jié)合型僅有膜鑲嵌區(qū)和胞內(nèi)段，沒有胞外段部分[11]。因此只有RAGE和sRAGE能與配體結(jié)合，膜結(jié)合型由于缺失胞外段不能與配體結(jié)合。而sRAGE缺少跨膜鑲嵌區(qū)和胞內(nèi)段，其AGE配體結(jié)合后，信號(hào)不能傳遞至胞內(nèi)，不會(huì)發(fā)生信號(hào)傳導(dǎo)通路的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，同時(shí)sRAGE可與RAGE競爭結(jié)合其配體，對(duì)機(jī)體的多種病理狀態(tài)起到保護(hù)作用[12]。降低AGE，阻斷RAGE表達(dá)量上調(diào)，刺激機(jī)體產(chǎn)生更多的sRAGE等，被認(rèn)為是緩解氧化應(yīng)激，預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化及其并發(fā)癥的方向標(biāo)[13]。腫瘤壞死因子超家族和白細(xì)胞介素是重要細(xì)胞因子之一，其通過免疫原、絲裂原等刺激劑誘導(dǎo)產(chǎn)生并通過旁分泌、自分泌或內(nèi)分泌等方式在靶器官巾發(fā)揮作用，機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，致病因子TNF-α，IL-10產(chǎn)生過多，保護(hù)因子IL-6受抑，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化損傷[14]。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為風(fēng)寒暑濕燥火等從經(jīng)絡(luò)傳人臟腑，導(dǎo)致痰濁、血瘀、痰瘀交阻是糖基化產(chǎn)物代謝紊亂慢性血管疾病的病機(jī)，是“痰濁”辨證的客觀表現(xiàn)，早在東漢時(shí)期，張仲景在《金匱要略》巾描述石斛具有益氣健脾，理氣活血，補(bǔ)脾益陽等功效，是溫陽健脾的重要代表方劑，現(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為石斛多糖有抗炎、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫功能、清除自由基等作用[15]。本研究結(jié)果顯示，用石斛多糖干預(yù)自發(fā)性高血壓大鼠，可明顯增高其IL-6和sRAGE水平，降低其TNF-α，IL-10，AGE及RAGE mRNA水平。提示石斛多糖可能通過降低AGE生成和積累，提高sRAGE表達(dá)，抑制RAGE活化，改善SHR大鼠炎癥功能紊亂狀態(tài)，在SHR的血管損害病理過程中起到保護(hù)性作用。中醫(yī)認(rèn)為動(dòng)脈粥樣硬化性疾病本為陰陽失調(diào)，標(biāo)為內(nèi)生之風(fēng)、痰濁和瘀血。治療上應(yīng)當(dāng)用活血化瘀，行氣通絡(luò)，豁痰利氣等[16-22]。本研究結(jié)果提示，石斛多糖可有效緩解SHR的炎癥反應(yīng)和晚期糖基化終末產(chǎn)物及其受體功能紊亂狀況。石斛多糖對(duì)改善SHR的癥狀有劑量效應(yīng)關(guān)系，改善炎癥癥狀巾等劑量，改善晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體癥狀的劑量比較高。石斛多糖為治療血管重塑提供新型的空間。

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（收稿日期：2019-04-09）

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金（81060028）;廣西重大專項(xiàng)基金（桂科重1598005-9，桂科攻1355005-3-7）;廣西衛(wèi)生基金（GXZC1242）。

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