金倩 范建高

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是遺傳易感和胰島素抵抗引起的代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝病，肝臟特征性病變包括大泡性肝脂肪變、小葉內(nèi)炎癥、肝細(xì)胞氣球樣變以及肝纖維化。隨著肥胖、2型糖尿病和代謝綜合征的流行，NAFLD已成為全球最常見(jiàn)的慢性肝病，其與肝硬化、肝癌和肝衰竭密切相關(guān)[1]。由于NAFLD患者的病理生理機(jī)制復(fù)雜，涉及肝臟各種類(lèi)型的細(xì)胞與環(huán)境及基質(zhì)效應(yīng)的相互作用，至今尚缺乏肝細(xì)胞脂肪變、脂肪性肝炎和肝纖維化的理想模型。目前廣泛使用的模式動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的主要局限性包括造模時(shí)間長(zhǎng)、人與動(dòng)物之間的遺傳學(xué)差異、存在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的倫理問(wèn)題，以及缺乏人類(lèi)NAFLD的典型疾病特征[2]。為此，近年來(lái)肝病的體外模型特別是肝臟芯片模型已用于NAFLD發(fā)病機(jī)制及新藥研發(fā)研究，相關(guān)進(jìn)展迅速。

一、肝病的體外模型

肝臟體外平面模型不能復(fù)刻人體肝臟諸多復(fù)雜結(jié)構(gòu)，尤其是參與肝纖維化形成的細(xì)胞-細(xì)胞的相互作用。使用原代人肝臟細(xì)胞培養(yǎng)可以有效解決這一問(wèn)題，但是由于存在異質(zhì)性，該方式的可及性和可重復(fù)性有限[3]?，F(xiàn)有的體外模型包括三維(3D)肝球體和生物打印3D模型，但這些模型是靜態(tài)的，缺乏多細(xì)胞的相互作用、適當(dāng)?shù)墓δ苤噩F(xiàn)、可提高模型相關(guān)性的原位生物分析能力和動(dòng)態(tài)線(xiàn)索[4]。為了加強(qiáng)NAFLD的病因及機(jī)制研究以及更高通量的藥物篩選以減少肝脂肪變性及其相關(guān)炎癥或纖維化反應(yīng)，亟需建立可重復(fù)且精確的仿生體外模型。理想的仿生體外模型需要滿(mǎn)足以下幾點(diǎn)：可復(fù)制肝臟的復(fù)雜結(jié)構(gòu)及相關(guān)細(xì)胞的代謝功能、合理的模型生理設(shè)計(jì)參數(shù)、非特異性吸收和藥物清除、通過(guò)相似的機(jī)制和試驗(yàn)終點(diǎn)模擬體內(nèi)對(duì)損傷的反應(yīng)[5]。

肝細(xì)胞的二維(2D)培養(yǎng)長(zhǎng)期用于疾病模型和藥物開(kāi)發(fā)，是最簡(jiǎn)單的體外肝細(xì)胞培養(yǎng)方法，包括肝星狀細(xì)胞的平面單培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)等。在個(gè)體發(fā)育過(guò)程中，多種發(fā)育信號(hào)精確調(diào)控，分化產(chǎn)生功能各異的細(xì)胞，并長(zhǎng)期穩(wěn)定地維持其生理功能。然而，功能細(xì)胞一旦離開(kāi)體內(nèi)微環(huán)境便會(huì)迅速去分化并失去功能。鑒于2D培養(yǎng)無(wú)法復(fù)制肝小葉內(nèi)動(dòng)態(tài)理化信號(hào)和微環(huán)境結(jié)構(gòu)等自然特征，2D時(shí)肝細(xì)胞功能通常會(huì)迅速喪失，2D研究不適用于肝臟長(zhǎng)期研究試驗(yàn)，并且研究結(jié)果不能簡(jiǎn)單類(lèi)推到人體。當(dāng)然在某些特殊情況下，微模式共培養(yǎng)物可數(shù)周保持穩(wěn)定并保留某些肝臟特有的功能[3]。但是，這些模型通常在體內(nèi)的基因表達(dá)和代謝活性的復(fù)制能力有限。

另一種肝臟疾病的體外模型是肝球體，重建類(lèi)似于天然結(jié)構(gòu)和功能的3D肝組織，包括肝細(xì)胞脂肪堆積和膠原沉積。然而，它們通常是靜態(tài)的，并且在多個(gè)細(xì)胞類(lèi)型的架構(gòu)和結(jié)合方面受到限制。為了改進(jìn)這一點(diǎn)，研究人員利用人體細(xì)胞開(kāi)發(fā)了3D模型，包括微流控、微生理平臺(tái)，稱(chēng)為“肝臟芯片”模型[6-7]。

二、肝臟芯片模型

肝臟芯片是一個(gè)3D體外肝臟微生理系統(tǒng)，一個(gè)微觀模擬肝細(xì)胞狀態(tài)和肝臟動(dòng)態(tài)理化環(huán)境的高通量系統(tǒng)將非實(shí)質(zhì)細(xì)胞(NPC)整合于由人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和組織巨噬細(xì)胞、庫(kù)普弗細(xì)胞組成的血管層以及由肝星狀細(xì)胞和肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞組成的肝細(xì)胞層，二者通過(guò)在灌注通道的入口和出口處添加發(fā)光傳感器，實(shí)時(shí)測(cè)量耗氧量[8]。肝臟芯片中的細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的分化和結(jié)構(gòu)重組，包括極化，但其功能僅穩(wěn)定4 d。另一個(gè)巧妙的設(shè)計(jì)是多尺度結(jié)構(gòu)層次，從而使需要長(zhǎng)期培養(yǎng)以觀測(cè)藥物清除以及區(qū)域性生理學(xué)研究成為可能[9]。然而，由于缺乏對(duì)正常肝臟生理至關(guān)重要的NPCs，該模型不能充分反映肝細(xì)胞功能和極化的生理調(diào)節(jié)。超大肝小葉(VLSLL)芯片模型由一個(gè)六角形組織培養(yǎng)室的集成網(wǎng)絡(luò)和一個(gè)單獨(dú)的種子飼喂網(wǎng)絡(luò)組成，模擬了肝小葉與中央靜脈的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)[10]。VLSLL芯片擁有膽小管網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)微流控內(nèi)皮樣屏障創(chuàng)建生物激發(fā)的人工肝竇系統(tǒng)。上述兩種模型通過(guò)模擬內(nèi)皮層的擴(kuò)散通道限制肝細(xì)胞通過(guò)，并保護(hù)肝細(xì)胞免受壓力，同時(shí)允許營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的擴(kuò)散。然而，這些非生物內(nèi)皮樣屏障不存在于人體，無(wú)法在體內(nèi)重現(xiàn)驗(yàn)證細(xì)胞-細(xì)胞相互作用和藥物代謝。

另一種通過(guò)恒定灌注以維持3D組織培養(yǎng)的裝置，將多個(gè)流體隔離的生物反應(yīng)器以多孔板的形式集合成一個(gè)陣列，每個(gè)生物反應(yīng)器包含一個(gè)支架介質(zhì)，從而形成數(shù)以百計(jì)的3D微型組織單元[11]，并與連續(xù)的介質(zhì)循環(huán)共同培養(yǎng)的肝細(xì)胞和肝竇內(nèi)皮細(xì)胞形成功能性肝樣組織。與靜態(tài)多孔板類(lèi)似，該系統(tǒng)中的生物反應(yīng)器是流體隔離的，不能結(jié)合兩個(gè)或多個(gè)單獨(dú)的組織培養(yǎng)孔。

三、NAFLD的肝臟芯片模型

油酸(OA)和棕櫚酸(PA)等游離脂肪酸(FFA)可用于誘導(dǎo)原代大鼠肝細(xì)胞脂肪變性，其中PA導(dǎo)致劑量依賴(lài)性細(xì)胞毒性效應(yīng)與活性氧(ROS)增加和白蛋白生成減少相關(guān)。NAFLD芯片設(shè)計(jì)一個(gè)包含人肝癌細(xì)胞株(HepG2細(xì)胞)的中央腔室，該腔室被緊密間隔的平行微通道包圍，以模擬內(nèi)皮細(xì)胞。為了使剪切應(yīng)力最小，介質(zhì)流經(jīng)一個(gè)通過(guò)微通道連接到中央腔室的單獨(dú)腔室。實(shí)驗(yàn)中，向培養(yǎng)物中添加OA和PA，48 h就可誘導(dǎo)NAFLD，可通過(guò)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯積聚、細(xì)胞活力和細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的測(cè)定[12]來(lái)揭示發(fā)病機(jī)制。

與單細(xì)胞培養(yǎng)相比，肝臟芯片模型具有復(fù)雜的細(xì)胞外基質(zhì)和膽管、緊密連接、橋粒、脂質(zhì)儲(chǔ)存等肝結(jié)構(gòu)，并進(jìn)一步改善了細(xì)胞色素P450(CYP)功能和表達(dá)。在另一個(gè)基于FFA的NAFLD模型中，使用12個(gè)帶有內(nèi)置泵的生物反應(yīng)器控制產(chǎn)生氧梯度的介質(zhì)的流量來(lái)模擬體內(nèi)條件[13]。裝置使用原代人肝細(xì)胞，向培養(yǎng)基中添加OA和PA共14 d，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)甘油三酯積聚、CYP2E1和CYP7A1等關(guān)鍵基因上調(diào)，并出現(xiàn)炎癥相關(guān)蛋白及肝損傷和纖維化。該模型通過(guò)顯示肝細(xì)胞甘油三酯含量減少，可用于篩選吡格列酮、二甲雙胍等治療脂肪肝的藥物。雖然肝細(xì)胞在高濃度的FFA作用下，通過(guò)降低CYP3A4等代謝酶活性以及表達(dá)多種脂肪因子，從而可以出現(xiàn)脂肪性肝損害。由于缺乏NPC，這種模型仍然缺乏NAFLD的一些特征性改變。

為了研究肝臟與其他器官的相互作用以及藥物動(dòng)態(tài)反應(yīng)，目前已研發(fā)成功將不同器官連接在芯片上的多器官平臺(tái)。例如，裝置由腸側(cè)膠原支架多孔膜隔開(kāi)的兩個(gè)腔室組成，Caco-2細(xì)胞植入腸腔，HepG2細(xì)胞植入肝腔[14]。無(wú)血清培養(yǎng)基灌流24 h后，再用含OA和PA的培養(yǎng)基灌流細(xì)胞24 h，然后對(duì)α-脂肪酸(ALA)、丁酸鹽和腫瘤壞死因子(TNF)-α干預(yù)后的肝脂肪變進(jìn)行定量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ALA降低了芯片和2D培養(yǎng)物中甘油三酯積聚；丁酸鹽通過(guò)增強(qiáng)腸屏障功能和減少肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚可減輕肝脂肪變性；腫瘤壞死因子-α則通過(guò)影響腸道誘發(fā)肝脂肪變性，在2D單層培養(yǎng)中則沒(méi)有這種現(xiàn)象。

綜上所述，體外肝細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)歷了從經(jīng)典單層培養(yǎng)模式到先進(jìn)的肝臟器官模型的轉(zhuǎn)變，可更精確地從時(shí)間和空間上控制細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)間相互作用。目前各個(gè)商業(yè)公司已開(kāi)發(fā)了多種用于研究肝病進(jìn)展、促進(jìn)藥物研發(fā)及藥物毒性試驗(yàn)的肝臟芯片模型，分別適用于不同研究目的的肝臟疾病相關(guān)試驗(yàn)，滿(mǎn)足客戶(hù)的個(gè)性化需求[4]。然而，生物工程技術(shù)仍然處于初級(jí)起步階段，還需要更多的研究工作來(lái)開(kāi)發(fā)代表性模型用于研究肝脂肪變及其相關(guān)肝炎肝纖維化的發(fā)機(jī)制和新藥研發(fā)。未來(lái)的發(fā)展方向可能集中在包含肝臟所有細(xì)胞類(lèi)型的設(shè)備開(kāi)發(fā)上。此外，對(duì)于肝臟模型研究進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)而不是終點(diǎn)分析,將更好地了解這些設(shè)備中的動(dòng)態(tài)變化，以便深入探討疾病相關(guān)演變過(guò)程和發(fā)生機(jī)制。隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)和完善，肝臟芯片技術(shù)有望在基礎(chǔ)生物學(xué)研究、制藥業(yè)和臨床肝臟病學(xué)領(lǐng)域有十分廣闊的應(yīng)用前景。