不同劑量伽馬射線輻射處理絲瓜花粉的效應

王博 張強 李季 蘇小俊 倪維晨 張強 錢春桃

摘要：以徐筒玉絲瓜為試驗材料，對絲瓜花粉先后分別進行250、400、500、750、1000、1250、1500、1600、1750、2000Gy等不同劑量的γ射線輻照處理，通過對處理后花粉活力的表現、坐果情況以及瓜內種子的比較，進行花粉輻照處理后的效應研究。結果表明，正常絲瓜的花粉活力為84.60%，授粉后坐果率為80%，經過γ射線輻照后花粉活力、坐果率顯著降低，輻射劑量為250、400、500、750、1000Gy的處理，花粉活力變化幅度為45.19%～72.48%，坐果率變化幅度為10%～60%，且二者整體均呈現逐漸下降的趨勢;在1000Gy以上的高劑量輻照下，花粉活力降為50%以下，授粉后均不能坐瓜。對老瓜內種子的比較發(fā)現，輻射劑量為250Gy處理時，種子外形飽滿與正常種子表現一致，發(fā)芽率達到84.50%，與正常種子發(fā)芽率85.25%相比差異不顯著;從400Gy處理開始，種子外形呈現干癟空殼狀且均不能萌發(fā)。研究結果表明，適合絲瓜輻射花粉授粉研究的劑量范圍應該介于250～400Gy之間。本試驗結果可為絲瓜輻射花粉誘導單倍體研究中花粉輻射劑量的選擇提供相關依據。

關鍵詞：花粉輻照;花粉活力;坐果率;發(fā)芽率

中圖分類號：S642.401文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2020）22-0135-04

作者簡介：王博（1994—），男，碩士研究生，研究方向為園藝作物栽培和育種。E-mail：2018804177@njau.edu.cn。

通信作者：錢春桃，教授，研究方向為園藝作物栽培和育種。E-mail：chuntaoq@njau.edu.cn。

絲瓜（LuffacylindricaRoem.）為1年生葫蘆科絲瓜屬作物，起源于亞洲熱帶地區(qū)，在全世界共有8個種，我國主要有普通絲瓜和有棱絲瓜2個栽培種，是我國常見瓜類蔬菜之一[1-3]。絲瓜生產規(guī)模的擴大對品種的培育提出了更高要求。目前，江蘇省乃至全國的絲瓜主要是常規(guī)育種，周期長、效率不高，而利用雙單倍體（doublehaploid，DH）進行育種可以縮短育種年限[4]。輻射花粉授粉和離體胚挽救技術是獲得葫蘆科作物雙單倍體的主要途徑之一[5]。

輻射花粉授粉是通過物理誘導的方法誘導植株體內的雌核發(fā)生，使未受精的胚囊細胞發(fā)育成胚，形成單倍體或雙單倍體材料[4]。目前，輻射花粉技術培養(yǎng)單倍體已在黃瓜[6]、甜瓜[7]、西瓜[8]等葫蘆科作物上廣為研究，楊泗海對絲瓜離體雌核發(fā)育誘導單倍體的胚培養(yǎng)環(huán)節(jié)培養(yǎng)基的設計展開了研究[9]，但是絲瓜輻射花粉誘導單/雙單倍體的研究目前尚未見報道。

本試驗對于絲瓜輻射花粉劑量效應的探索是整個輻射花粉途徑，是一項必要的誘導培育絲瓜單倍體研究的基礎工作，為了高效誘導絲瓜單倍體，確定適宜的輻射劑量非常重要[10]。在已有的葫蘆科作物黃瓜[6]、甜瓜[7]輻射花粉誘導單倍體的研究中，適宜的輻射劑量為200～350Gy。在甜瓜上，研究者一般設定的輻射劑量范圍為150～2500Gy[11～15]，因此在本研究中設計了10個劑量處理，分別為250、400、500、750、1000、1250、1500、1600、1750、2000Gy。

1材料與方法

1.1材料

試驗在南京農業(yè)大學（常熟）新農村發(fā)展研究院4號大棚內進行。試驗材料主要為徐筒玉絲瓜品種，于2019年春季3月中旬播種，采用電熱溫床育苗，4月1日定植于大棚內，定植后進行常規(guī)栽培管理。試驗配套的器材用具主要包括用于保存花粉的防曬泡沫保溫箱、冰盒、冰塊等。

1.2方法

1.2.1輻射處理

試驗于2019年6—8月進行，在蘇州大學獨墅湖校區(qū)906幢輻照中心進行，輻射前1d下午套雄花，輻射當天早晨取雄花置于冰盒中，分別進行250、400、500、750、1000、1250、1500、1600、1750、2000Gy的γ射線輻照處理，每個劑量處理時間均為60min。

1.2.2花粉活力測定

取輻射當天各個劑量的花粉，參照張琛等研究中利用TTC法進行活力測定的方法[16]設計花粉活力測定試驗，具體操作步驟為：取各個劑量花粉少許放在干潔的載玻片上，加1～2滴0.5%TTC溶液，攪勻后蓋上蓋玻片，并用清水作對照。置35℃恒溫箱中，30min后鏡檢，凡被染為紅色的花粉活力強，淡紅次之，無色者為沒有活力或不育花粉。每片取3個視野，統計花粉的染色率，以染色率表示花粉的活力百分率。

1.2.3輻射花粉授粉及性狀統計

輻射當天下午套雌花，第2天早晨進行各個劑量輻射花粉的授粉工作，每個輻射劑量授10朵雌花，授粉后進行常規(guī)的栽培管理。至商品瓜時期即授粉后10d，對坐果率進行統計;授粉后50d，取得到的老瓜內種子進行形態(tài)觀察以及種子的萌發(fā)率統計。種子的萌發(fā)率測定參照黃樹蘋等研究中絲瓜種子發(fā)芽率的測定方法[17]，具體操作步驟為：將各個輻射劑量處理的瓜內種子各挑出100粒，每個處理4次重復，起始采用50℃左右溫水浸種15min，此后置于清水中浸泡12h，并且每間隔4h換1次清水，浸種結束后用毛巾包裹放在30℃恒溫光照培養(yǎng)箱內進行催芽。催芽期間分別于早上和晚上將種子拿出透氣并清洗毛巾和種子。數據統計方法：發(fā)芽率=8d內發(fā)芽種子數/供試種子數×100%。

2結果與分析

2.1不同輻射劑量對花粉活力的影響

從表1可以看出，花粉活力隨著輻射劑量的增大整體呈現下降的態(tài)勢，僅在500、1250、1500Gy下處理出現反常，對應的花粉活力出現相應小幅度回升。未經輻射的花粉活力很強，達84.60%，而經輻射過的花粉活力變化幅度在18.28%～72.48%之間，各個劑量的輻射花粉的活力均低于未經輻射的花粉，差異均達顯著水平，說明輻射能夠顯著降低絲瓜的花粉活力。當輻射劑量為250、400、500、750Gy時，花粉活力均在50%以上;輻射劑量為1000、1250、1500、1600Gy的處理，花粉活力已降低至50%以下，當輻射劑量達到1750Gy時，花粉活力下降至22.83%，不足30%;當輻射劑量為2000Gy時，花粉活力降低至18.28%，不足20%，說明輻射會在一定程度上降低絲瓜的花粉活力，且劑量越大，降低的效應越明顯。

2.2不同輻射劑量對坐果率的影響

從表2可以看出，正常授粉的絲瓜坐果率達到80%，輻射花粉授粉的絲瓜坐果率變化幅度在0～60%之間，比較而言，輻射花粉授粉的瓜坐果率均低于正常授粉的絲瓜，說明輻射花粉對絲瓜的坐果率有一定的影響。當輻射劑量為250、400、500、750、1000Gy時，坐果率依次下降，輻射劑量為1000Gy的處理，坐瓜率僅為10%，輻射劑量高于1000Gy均不能坐果。表明在一定輻射劑量范圍內，輻射花粉授粉會使絲瓜的坐果率降低，且高劑量的輻射花粉授粉會嚴重影響絲瓜的坐果率。

2.3不同輻射劑量下老瓜內種子的比較

試驗中輻射劑量高于1000Gy時均未能坐瓜，

[FK（W15][HT6H][JZ]表1不同輻射劑量下絲瓜的花粉活力并未得到種子，對其他輻射劑量得到種子的觀察結果如圖1所示，正?；ǚ凼诜鄣墓蟽确N子為黑色種皮，種子飽滿，外形呈橢圓狀，輻射劑量為250Gy的處理與正?；ǚ凼诜鄣墓戏N子外觀上與正常瓜種子相似，無明顯差別（圖1-a、圖1-b）;輻射劑量為400、500、750、1000Gy的處理瓜內種子外觀相似，均為橢圓狀干癟空殼的種子（圖1-c、圖1-d、圖1-e、圖1-f）。對這些得到的種子發(fā)芽率統計結果見表3。

從表3可以看出，正常授粉的瓜內種子發(fā)芽率為85.25%，輻射劑量為250Gy處理的發(fā)芽率為84.50%，二者之間差異不顯著，而輻射劑量為400、500、750、1000Gy處理的瓜內種子均未能萌發(fā)。綜合種子外觀比較而言，250Gy的劑量處理下瓜內形成的種子為發(fā)芽率正常的絲瓜種子，而400Gy及以上的劑量處理瓜內形成的種子是干癟空殼狀、不能正常萌發(fā)的種子。

3討論與結論

試驗結果表明，輻射導致絲瓜花粉活力顯著降低，且隨著輻射劑量的增大，花粉活力降低得越明顯，在本研究中1750、2000Gy高劑量處理的花粉活力降低至30%以下，這可能是由于輻射破壞了花粉細胞的內部結構[18]，從而導致花粉細胞活力降低，進而使得花粉表現出來的活力下降，試驗結果表明，劑量越大，花粉活力越低，說明高劑量輻射給花粉細胞帶來的傷害作用越明顯。

從坐果情況來看，輻射花粉授粉后，坐果率相比正常絲瓜均降低，且劑量越大，坐果率越低，當輻射劑量超過1000Gy后絲瓜已很難坐果，這可能是由于輻射后花粉活力降低導致的。曾輝等研究認為，花粉活力與坐果率的高低直接相關[19]。在薛浩等關于甜瓜輻射花粉的研究結論中，輻射劑量在200～1500Gy時，對坐果率沒有明顯的影響;而在2000Gy時，坐果率明顯降低[10]，本研究結果與之不完全一致，可能是由于試驗材料的不同所致。Visser等認為，輻射劑量與植物的倍性、花粉粒的大小有關，倍性越高、花粉粒越小，越耐輻射[20-21]，對于絲瓜來說，其花粉粒比甜瓜要大，因此相比甜瓜不耐輻射，所以才會出現輻射后花粉活力、坐果率均顯著降低的結果。

從收得的老瓜種子來看，250Gy的劑量輻照形成的種子在形態(tài)和萌發(fā)率上與正常種子相比均無較大差別，而400Gy及以上的劑量輻射形成的種子均為干癟空殼，且這些種子均不能正常萌發(fā)，說明400Gy的劑量輻射已不足以使絲瓜形成正常種子，由此可推測適合絲瓜輻射花粉授粉研究的劑量范圍應該在250～400Gy之間，本結論與張永兵等關于輻射花粉誘導甜瓜單倍體的研究中“適宜誘導培育單倍體劑量為300Gy”的結論[13]相似。今后將在250～400Gy之間設計更為精細的劑量篩選試驗，并結合胚拯救技術，開展絲瓜單倍體的培育研究。

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